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双光子和光谱扫描在激光共聚焦显微镜上的应用经验浙江大学生命科学学院仪器与技术服务平台机型： Zeiss LSM710 nlo32通道阵列 PMT690-1080nm可调谐飞秒激光器激光共聚焦显微镜的非常规应用 利用双光子分辨目标荧光和自发荧光 利用光谱扫描鉴定微弱荧光信号的真假 转基因材料快速筛选 嘈杂背景下的细胞计数 非线性效应 光刻和深度扫描 模拟近红外光源GFP标记水稻根中自发荧光的清除单光子激发，水稻根带有强烈的黄绿色自发荧光 双光子激发，自发荧光为蓝色ex 488nm， Lambda mode ex 820nm , lambda modeGFP标记水稻根中自发荧光的清除 双光子激发下 GFP荧光与自发荧光的波长分离， 820nm激发时，仅采集 493-542nm区间的信号以保证特异性Ex 820nm, channel mode 微弱或自发荧光存在下的信号鉴定Promoter:GFP载体注射烟草叶片（ lambda mode成像）转 GFP弱表达 转 GFP不表达镜下目视特征：绿色信号被强烈红光掩盖GFP和 RFP弱时无法分辨Lambda合成图特征 ：GFP：绿色偏蓝自发荧光：绿色偏黄叶绿素荧光：红色光谱特征：GFP：主发射峰位于约 518nm副发射峰位于约 540nm后者高度约为前者的一半呈台阶形自发荧光：在 560nm左右对称分布叶绿素荧光：625nm以上强烈信号GFP 叶绿素转基因材料的快速筛选原则：密集预排列待测样技巧： lambda扫描 色彩判别 荧光峰形检查GFP蓝绿特征色 GFP台阶形特征峰518540土壤浸出液中外源 GFP标记细菌浓度分析目的：了解土壤中的不同细菌间的竞争关系方法：等比掺入外源 GFP标记菌体，设置多种环境条件问题：土壤标本背景嘈杂，往往带有各种带荧光的杂质颗粒解决：1 固定样品体积2 lambda成像检测 GFP特异荧光3 最大化 pinhole非线性效应：碳纳米管498518421原理：某些材料在双光子激发，会发射波长为激发光一半的荧光利用不同波长的双光子激光照射可能含碳纳米管的靶向药物， lambda扫描发现荧光信号呈现严格的倍频关系Ex 850Ex 1000Ex 1040光刻和深度扫描一种人工合成的透明有机晶体，在一定强度的近紫外光下会发生局部变性，从而具有双光子效应在 2个不同 Z坐标下做 bleach， ex 458nm ex 900nm 做 z-stack，显示多层光刻效果，信号随深度增加而衰减
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