基因诊断与治疗

第六篇 基因疾病与治疗一、人类所有疾病均可视为基因病按参与疾病的基因的性质和来源，可将基因病分为 3大类 :单基因病（ monogenic disease） :由一种基因所引致。多基因病（ polygenic disease） :由数目不等、作用不同的若干种基因相互协作而引起。获得性基因病（ acquired genetic disease） :由外源性病原体携带其致病基因或毒力基因侵入人体细胞后所引起。二、疾病基因与遗传易感性有关三、基因突变可能诱发疾病四、基因突变改变表达产物的“质 ”和 “量 ”引起疾病正常基因称为 野生型基因 ，具有野生型基因的细胞或个体称为 野生型 （ wild type）。基因突变（ gene mutation），携带突变基因的各种类型的细胞或个体称为 突变体或突变型 （ mutant）。研究基因与疾病关系主要目的在于： 确定致病基因或疾病易感基因； 阐明这些基因的功能和在疾病发生发展中的作用机制； 指导临床诊断、治疗和预后的实践。 传统的疾病诊断方法基 因 诊 断Gene Diagnosis 基因诊断又称分子诊断， 就是应用分子生物学和分子遗传学的原理、技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断可用于单基因病、多基因病及感染性疾病诊断。基因诊断的特点特异性强目标是与疾病相关的基因，是原始的致病因素。灵敏度高基本技术是分子杂交和 PCR，微量标本即可进行诊断。可实现早期诊断应用范围广泛l 核酸分子杂交l 聚合酶链式反应l 单链构象多态性（ SSCP）检测l 限制性片段长度多态性（ RFLP）分析l DNA序列测定l 芯片技术l 免疫印迹l 免疫组织化学法基因诊断的基本技术结合目的选择基因诊断技术路线和方法l 点突变的检测：导致特异性限制性核酸内切酶位点改变：无特异性限制性核酸内切酶位点改变：l 基因序列缺失 /插入的检测：RFLPPCR-ASO,SSCP核酸分子杂交， PCRl 转录水平检查基因表达异常： RT-PCR, RT-qPCRl 疾病易感性检测（ SNP检测）： RFLP导致某一限制酶识别位点丧失或获得的点突变，分析限制性酶切图，即可诊断出此类突变。x110bp 34bp 76bpPCR-RFLPASO1ASO2 ASO1, 不完全杂交NormalASO2, 不完全杂交Mutant等位基因特异性寡核苷酸（ allele specific oligonucleotide， ASO）探针斑点印迹杂交分析法PCR/单链构象多态性分析(single strand conformation polymorphism, SSCP)基 因 治 疗（ gene therapy）通过一定方式将人正常或野生型（通过一定方式将人正常或野生型（ wild type）基因或有治疗作用的）基因或有治疗作用的 DNA片段导入人体靶片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法。细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法。 一、基因治疗的策略l 基因置换矫正基因缺陷l 基因添加矫正基因缺陷添加缺陷基因或治疗基因l 基因干预抑制某个基因的表达反义核酸、核酶 、干扰 RNA技术l 自杀基因治疗恶性肿瘤l 基因免疫治疗肿瘤反义核酸技术核酶的作用机制 天然核酶多为单一的 RNA分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由两个 RNA分子组成。自杀基因的作用机制 载体目的基因in vivoex vivo 靶细胞二、基因治疗的流程基因转移可由病毒和非病毒介导l 病毒介导（生物学方法）：反转录病毒腺病毒腺相关病毒l 非病毒介导（非生物学方法）：脂质体受体直接注射其他：磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、 DEAE-葡聚糖法、细胞显微注射、基因枪p 两端各有一长末端重复序列 LTR。 反转录病毒前病毒的结构特点p LTR由 U3、 R和 U5三部分组成。p 病毒有三个结构基因p 5端 LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（ ）及剪接供体位点 (SD)和剪接受体位点 (SA)。l 在 U3内有增强子和启动子； l U3和 U5两端分别有病毒整合序列 (IS) ；l 在 R内还有 poly(A)加尾信号。l gag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原；l pol基因，编码反转录酶；l env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白 (包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白 )。反转录病毒包装脂质体介导的基因转移示意图目 录受体介导转移技术示意图目 录存在问题 许多基因缺陷的早期诊断还有困难 间接体内法回输的转基因细胞不可能在体内长期存活 ; 有些