实验一培养基的制备与灭菌

微生物学实验生物工程类实验要求l 课前充分预习，上课不无故缺席，实验报告要及时上交。l 实验期间不得大声喧哗、服从老师的安排、注意安全。l 实验器材专人专用 ，对仪器要爱护，损坏实行赔偿制度。l 实验菌种和物品未经许可，不得携出室外，用后的菌种按老师要求妥善处理。l 维护好实验室的环境卫生，实行值日生制度。实验报告要求l统一用 A4纸 手写 实验报告l封面格式1、实验课程名称2、实验项目名称3、学生所在的专业、班级、姓名、学号4、实验日期5、同组者姓名l实验报告格式1、实验目的2、实验原理3、实验仪器、溶液试剂4、实验步骤5、实验结果（如绘图、列表等）6、思考题l实验成绩的组成平常成绩 30 （实验操作表现、实验报告）操作考试 30笔试成绩 40实验内容l 土壤中微生物的分离纯化与活菌计数l 显微镜的使用及酵母菌、放线菌的形态观察l 霉菌的形态观察l 油镜的使用、细菌的单染色和革兰氏染色l 微生物大小测定、显微镜直接计数法l 微生物生理生化反应l 水中细菌总数和总大肠菌群的测定l 微生物的紫外诱变（一）培养基的制备与灭菌实验一、土壤中微生物的分离纯化与活菌计数一、培养基的制备l目的要求明确培养基的配制原理通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤 按培养基的用途分基础培养基鉴别培养基选择培养基 按培养基的物理状态分固体培养基半固体培养基液体培养基 按成分不同分天然培养基合成培养基半合成培养基基本原理培养基的配方l 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（一种天然培养基，用于分离和培养细菌）l 配方：牛肉膏 3g蛋白胨 10g氯化钠 5g琼脂 20g水 1000mlpH 7.2-7.4灭菌 121 20min l 高氏 号 培养基（一种合成培养基，可用于培养放线菌）l 配方：可溶性淀粉 20gKNO3 1gNaCl 0.5gK2HPO4 0.5gMgSO4 0.5gFeSO4 0.01g琼脂 20g水 1000mlpH 7.2 7.4灭菌 121 20min l 固体淀粉培养基（一种鉴别培养基，用于大分子物质水解的生理生化鉴定）l 配方：蛋白胨 10g氯化钠 5g牛肉膏 5g可溶性淀粉 2g蒸馏水 1000ml琼脂 15 20g灭菌 121 20min器材l溶液或试剂 4mol/L NaOH， 1mol/L HCl，各类培养基的配方药品。l仪器或其他用具 试管，三角瓶，搪瓷杯，量筒，天平，药匙，电磁炉，高压蒸气灭菌锅， pH试纸 (pH5.5 9.0)， 硅胶塞，棉花，报纸，记号笔等。操作步骤（一）1 计算 ： 根据配方按照用量计算。2. 称量：3 溶解： 如有琼脂，要不断搅拌 避免糊底 。4、 调节 pH： 用 1mol/L NaOH或 1mol/L HCl调节，以 pH试纸或 pH计测定。5 过滤： 趁热用四层纱布过滤。操作步骤（二）6.分装 试管：固体不超过试管高度的 1/5；液体、半固体不超过试管高度的 1/4或 1/3 。三角烧瓶：总体积的 一半 为限。l 管口或瓶口不得沾有培养基操作步骤（三）7.加塞1.正确； 2.管内部分太短，外部太松； 3.外部过小操作步骤（三）8.包扎： 注明培养基的名称。9.灭菌 ： 按各自培养基灭菌的温度、时间灭菌。10.搁置斜面 (1/3 l/2， 不能超过 1/2)。11.无菌检查l实验无菌器皿的准备无菌水：在试管或三角瓶内量取实验所需的自来水， 经121 20min灭菌。无菌 移液吸管 、 培养皿 ：报纸包扎后，经 121 20min灭菌。了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。目的要求二、消毒与灭菌灭菌是指杀死一切微生物的营养体，芽孢和孢子。消毒则指消灭病原菌和有害微生物的营养体，因而只是部分灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。 基本原理l 干热灭菌火焰灼烧法干热灭菌法 （烘箱内热空气灭菌法）l 湿热灭菌法加压蒸汽灭菌法l 紫外线灭菌法l 微孔滤膜过滤除菌火焰灼烧法l 直接在火焰上灼烧灭菌l 主要用于实验室接种针 (环 )、试管口、三角瓶口和金属小工具等的灭菌。干热灭菌法l 设备：电热烘箱l 适用于耐高温器皿， 160-170 ，维持 2小时l 注意事项： 温度不可超过 180 ，以防玻璃器皿上的棉塞及包装纸烤焦着火。 灭菌时物品不宜堆放得太紧，以免妨碍空气流通。 灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。 电烘箱内温度 70 时，方可打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。2.湿热灭菌 (一）l 高压蒸汽灭菌法 ： 是将物品放在高压蒸汽灭菌锅内0.1MPa， 121 保持 15 30min进行灭菌，从而导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌为准。此法适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。原因一：湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低。 卵白蛋白含水量 /% 30分钟内凝固所需温度 /50 5625 748018 80906 1450 160170蛋白质含水量与凝固所需温度的关系原因二：湿热的穿透力比干热大。原因三：湿热的蒸气有潜热存在。温度 / 时间/h透 过 布 层 的温度 /灭 菌干 热1301404 86 72 70.5 不完全湿 热 105.3 3 101 101 101 完全在同一压力下，含有空气的蒸汽所达到的温度低于饱和蒸汽的温度，所以 排气 是否完全很重要。l 间歇灭菌法： 应用于不易于高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，每天加热 10030min 、连续三天，可彻底灭菌。l 煮沸消