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噻托溴铵对哮喘模型小鼠气道炎症与气道重塑的治疗作用Effect of tiotropium bromide on airway inflammation and remodeling in a mouse model of asthmaFrom: Clinical and Experimental Allergy前 言 支气管哮喘是一种有 嗜酸性粒细胞 ,肥大细胞 和 T淋巴细胞 等多种炎性细胞参与的以气道 慢性炎症 为特征的疾病。这种气道炎症是易感者对各种激发因子具有气道反应性,并可引起气道狭窄,表现为反复发作性的喘息、呼吸困难、胸闷或咳嗽等症状。其存在的病因 杂而多 ,包括遗传的、环境的、药物的、精神的等等。前 言哮喘的发病机制归结为四种: 变态反应 气道炎症 气道高反应性 神经机制内 容研究背景1材料方法2实验结果3讨 论4研究背景一、哮喘特征: 气流阻塞 气道炎症性 气道高反应性 二、炎症细胞: 肥大细胞 淋巴细胞 嗜酸性粒细胞研究背景一、哮喘的典型活性介质: IL4 IL5 IL13 IFN TGF二、活性介质与哮喘的关系: 与 Th1细胞的关系 与 Th2细胞的关系 与嗜酸性粒细胞( EOS)的关系 研究背景噻托溴铵 ( 商品名 思立华 ) 是目前世界上推崇的新型 抗胆碱能药物 ,它是一种季铵类抗胆碱能类支气管扩张剂,对支气管扩张作用可持续 24 小时,明显改善喘鸣及气促的症状,显著提高肺功能。因而,本实验的 目的 是评估噻托溴铵是否可以抑制哮喘模型小鼠变态反应导致的急性与慢性气道炎症、 Th2类型细胞因子产生以及气道重塑。实验材料与方法实验动物: BALB / c小鼠、雌性、 6-8周、重量 19-24 g试 剂:卵清蛋白( OVA) Sigma噻托溴铵 Boehringer Ingelheim4-二苯乙酰氧基 -N-甲基 -哌啶甲碘化物( 4-DAMP) BoehringerIngelheim实验流程图检测指标动物造模记录并分析结果 给药BALF 肺病 理 气道反应 离体细胞 PBMCs急性和慢性气道炎症小鼠模型的建立Day 0Day 12Day 0Day 12 Day 21-23Day 23-26 Day21-6350 g/mouse OVA i.p. 0.1mM (50 g/mL)Inhalation for 3 min/mouse 2.5% OVA inhalation for 20 min/mouse 气道反应的测量操作流程:麻醉小鼠 插管 装箱 测量 记录结果计算公式: (吸入 5 -羟色胺后的气道阻力 /吸入前的气道阻力 ) 100% 支气管肺泡灌洗和细胞的分析 操作流程:处死动物 钝性分离气管 固定气管 生理盐水冲洗 收集BALF 冰块保存 离心收集细胞 细胞冲洗与悬浮 细胞计数 细胞分类肺组织病理分析 操作流程:提取 BALF后 打开胸腔 剪取肺组织 PBS浸泡过夜 乙醇脱水 包蜡 染色显微镜观察 分析指标 上皮细胞增生、气道平滑肌增生、胶原纤维沉积、 M3受体脾细胞因子的测量操作流程:分离脾细胞 悬浮培养 添加噻托溴铵 OVA( 100 g/mL)刺激 获取培养上清液 测量细胞因子培养液成分: RPMI 1640、胎儿牛血清和抗生素细胞悬浮浓度: 4.0106 个 /mL.人类外周血单核细胞因子的测量操作流程:获取患者全血 分离 PBMC 细胞培养 植物血凝素( PHA)激发 噻托溴铵治疗 获取细胞培养液上清 ELISA测量 IL5 与 IL13分离方法:运用淋巴细胞分离器采取 密度梯度离心法细胞因子的测量操作方法:酶联免疫吸附测定 法( ELISA法)检测样品: BALF与细胞培养上清 因子种类: IL4 、 IL5 、 IL13 、IFN 、 TGF 1实验结果一、对气道 炎症反应 的影响 噻托溴铵能有效地防止变态反应导致的 急性炎症反应 噻托溴铵能同样有效地抑制 慢性 哮喘模型小鼠的炎症反应实验结果二、对支气管肺泡灌洗液中 Th2类型 细胞因子 水平的影响选取并被测量的细胞因子是 IL4 、 IL5与 IL13 ,这三者与哮喘的发生和发展有着密切的关系。同时,慢性模型还考虑了 TGF-1,然而,噻托溴铵对模型小鼠中 IgE的含量影响不大。实验结果三、对 气道重塑 的作用气道重塑涉及到 上皮细胞增生 、 嗜酸性粒细胞募集 、 -肌动蛋白增多 、 气道纤维化 等病理改变,因而,可以从这几项指标检测噻托溴铵对气道重塑的改善作用。同时 由于 M3受体 的发现,为阐明其作用机制提供可能的依据。实验结果四、慢性哮喘模型小鼠 气道高反应性气道高反应性是哮喘的典型特征,尤其在慢性哮喘中表现明显,这可通过测量 气道阻力 来反映是否具有气道高反应性。实验结果五、对 脾细胞因子 的

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