实验五培养细胞的形态观察和计数

实验 五培养细胞的形态观察和计数 实验目 的了解 培养中 的动物细胞的 一般形态 和生长状态 ； 掌握细胞计数的基本 方法 。 实验用品一、材料和标本 培养 中的几种 细胞。二、器材和仪器 倒置显微镜、细胞计数板、普通光学显微镜、乳头吸管。三、试 剂 0.3% 台盼兰染液 等实验内容 一、培养细胞的形态观察 (一 )原理 体外培养的细胞主要有两种状态。一种是能贴附在培养支持物上的细胞 , 如 内皮 细胞 ,叫贴壁型细胞 。 体外培养的细胞绝大多数都属于这种细胞。另一种细胞 -并不贴附在容器的壁上 ， 而是悬浮在培养液中生长 ，如 HL-60, 叫做悬浮型细胞 ,这类细胞主要是血液原性或癌原性的细胞。 (二 ) 操作 1.从培养箱中取出细胞培养瓶 ,注意观察细胞培养 液 的颜色和清澈度。然后 ,将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上。 2.打开倒置镜光源 , 通过双筒目镜将视野调到合适的亮度。 3.调节载物台的高度进行 对 焦 , 在看到细胞层之后 , 再用细调节器将物像调清楚 , 注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构。在观察时 ， 最经常使用的是 10 物镜。（三） 结果 贴壁细胞 一 般有两种形状 ,即上皮细胞形和成纤维细胞形细胞。上皮细胞形细胞呈扁平的不规则多角形 ,圆形核位于中央 ,生长时常彼此紧密连接成单层细胞片 , 如 HeLa 细胞。成纤维细胞形细胞形态与体内成纤维细胞形态相似 ,胞体呈梭形或不规则三角形 ,中央有 圆 核 ,胞质向外伸出 2 3个长短不同的突起 ,细胞群常 借 原生质突连接成网,如 NIH3T3。贴壁细胞 在生长状态良好时 ,细胞内颗粒少 ,看不到有空泡 ,细胞边缘清楚 , 培养基内看不到悬浮的细胞和碎片 ,培养液清澈透明 ,而当细胞内颗粒较多 ,透明差 ,空泡多时 ,表明生长较差。当瓶内培养基混浊 时， 应想到 细菌 或 真菌 污染的可能。悬浮细胞 当边缘清楚 ,透明发亮时 ,生长较好 ； 反之 ,则 较差或已死亡。 由于培养基内有 pH指示剂的存在 ,因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色 ， 细胞一般生长状态较好 ； 呈淡黄色时 ,则可能是培养时间过长 ,营养不足 ,死亡细胞过多 ； 如呈紫红色 ,则可能是细胞生长状态不好 ,或已死亡。 一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的,它随营养、 pH、 生长周期而改变 ,但在比较稳定的条件下形态基本是 一 致的 。 在贴壁细胞培养中 ,镜下折光率高 ,圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞。肿瘤细胞有重叠生长的特征。二 、 培养细胞的计数及活细胞的鉴定（一）原理细胞生物学的实验中 ,往往要进行活细胞的鉴定和细胞的计数、调整细胞的密度 ,是进行实验必不可少的一种基本技能。（ 二 ） 操作1.将培养瓶中的培养液倒人干净试管中 ,向培养瓶中加入 0.25%胰 蛋白酶 /0.02% EDTA混合消化液 1.0m1,静置 3 5分钟 ,待见到细胞变圆 ,彼此不连接为止。2.将试管中的培养液倒回培养瓶中 ,并轻轻进行吹打 ,制成细胞悬液。3.取细胞悬液 0.5m1,加入 0.3%台盼兰染液 0.5ml时 ,混合后染色 3 5 分钟。4.滴加少许已染色的细胞悬液于放有盖片的细胞计数板的斜面上 ,使液体自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生 ,否则要重新滴加。在普通光镜 10 物镜下计数四个大格内 (如图 1， 2 示 )的细胞数 ,压线者数上不数下 ,数左不数右。（三）结果 细胞浓度计数 4大格细胞总数 104 稀释倍数 /4 = 细胞数 ml （ 4大格中细胞总数染色细胞） 104 稀释倍数 /4 = 活细胞数 ml悬液 注 4大格中的每一大格体积为 0.l mm3。 1ml10000大格，因此， 1大格细胞数 104 细胞数 ml。 注 染色标本在 15分钟内检查计数，因为台盼兰染液可以迅速地使死细胞