chap10糖基化工程和糖生物学应用2010

糖生物学第十章 糖基化工程糖基化工程v糖基化工程的含义和意义v影响糖基化的因素v糖基化工程的手段v糖基化的监测v常用表达体系的糖基化特点v糖基化工程技术及其应用Protein Market (2000)167 productsRecombinant Protein Vaccines$2,135 MOthers$275 MHerceptin$440 MRituxan$650 MEnbrel$3.5 billionMonoclonal Antibodies/Other$535 MCerazyme/Ceredase$300 MAlpha-glucosidase $0.8 billionEnzymes$4,700 MEPO$3,000 MInterferons $7.5 billionComplex Proteins$350 MFactor IX$1,000 MFactor VIII$3,000 MInsulin$4.35 billionBlood Products$284 MFibrinogen$350 MCollagen$1,300 MHuman Serum Albumin$2 billionStructural ProteinsEPO2005年销售额超过百亿美元Biogenerics: expiry date of patent and market贫血v贫血是指循环中红细胞的数量和血红蛋白浓度低于正常值，不足以维持血液组织正常氧和作用的代偿机制病症。最常见的是缺铁性贫血、再生障碍性贫血、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血等。 v治疗 (Pre-1989): 红细胞疗法（输血，连同维生素和矿物质）。v问题 : 对某些贫血不太有效。Erythropoietin， EPOv美国 Amgens 于 1989年开发了 Epogen（recombinant human erythropoietin， rhEPO）v促红细胞生成素 (erythropoietin, EPO) 水平在经历了化学疗法的癌症患者体内很低（尤其是肾衰竭者）。EPO可以刺激红细胞的生成， 并具有神经保护剂功能。v适应症 : 红细胞生成不足引起的贫血 (来自肿瘤化疗、AIDS、慢性肾衰竭等 )Erythropoietin Drug developmentFirst cloned and expressed in bacteria: E. coliBacterial EPO is fully active:binds to tightly to the EPO receptorstimulates erythroid developmenthas different binding kinetics than native hEPOwhile bacterial rhEPO is 500-fold less effective in vivoN-linked glycans on EPOHigh mannose N-glycans Complex N-glycansno sialic acid 3-4 sialic acid terminino negative charges 3-4 negative chargesSialic acid modication varies from 0-4 residues per N-glycan3条 N-糖链均为复杂型have different numbers of glycosylation and sialation sites (%)Different Biotech Formulationv Some hrEPOs with varying sites of glycosylation (a post-translation modification of protein) outlast others. Amgens Biotech BusinessvAmgen的两大拳头产品：n erythropoietin Epogen (epoetin alpha)n colony stimulating factor Neupogen (filgrastim). v继 Epogen后开发的新一代 EPO产品仍是市场领军者：n Aranesp (darbepoetin alpha) ：增加了两个Asn，使每分子 EPO的唾液酸基团数量增加到 22个。n Neulasta (pegfilgrastim)：对 Neupogen进行PEG化修饰PharmaFocus 2003重组表达的药用糖蛋白v世界生物医药市场主要品种大多为糖蛋白： rhEPO、GM-CSF、 tPA等。全球产值约数百亿美元。v糖蛋白中的糖链对于药物在体内的稳定性、活性、靶向性及药代动力学有显著的影响，因此在开发这类药物时控制其糖基化具有较大的重要性。大多数情况下，对产品的糖基化必须予以优化和质量控制。唾液酸化程度对 EPO活性的影响v天然的和重组的 EPO含有三条唾液酸化的复杂型 N-糖链。v唾液酸化程度对 EPO的体内半衰期有很大影响。v培养基 pH、 前体或营养成分的可利用性、不同细胞因子和激素的存在、细胞株中糖基转移酶和糖苷酶活性的强弱等因素均能影响培养细胞产物糖基化程度、分支程度、唾液酸化程度、硫酸化程度等。酶替代疗法中溶酶体酶的靶向v溶酶体贮积性疾病vGauchers disease（ 葡萄糖脑苷脂酶缺陷）的酶替代疗法需要通过细胞表面的 Man受体靶向到巨噬细胞的溶酶体。v可由哺乳动物生成的含有 N-聚糖的酶经糖苷酶（唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶等）降解产生。v也可由杆状病毒 -昆虫细胞表达系统加工生产。糖基化工程的目的v控制蛋白质上的寡糖链加工，使其n 增加合成及分泌的效率n 增加溶解度n 延长体内半衰期：如 rhEPO的 Sia基团n 增强对抗蛋白酶的稳定性n 增加生物活性n 降低抗原性n 靶向导入：如在酶替代疗法中溶酶体酶的靶向n 有助于蛋白质的纯化等影响糖基化的因素v多肽链自身结构n 潜在糖基化位点的分布和数目n 蛋白质的空间结构v宿主系统糖基转移酶的表达v细胞培养的环境条件糖基化工程的手段v体内控制n 利用 不同表达系统 的糖基化差异n 利用基因工程改变肽链上的糖基化位点n 与 GPI信号肽融合表达n 重组表达糖基转移酶和糖苷酶等v体外修饰n 利用 天然的和合成的糖基化抑制剂n 利用糖苷酶切除不需要的糖基n 体外合成糖链n 精确控制培养条件常用表达系统的糖基化差异（一）v原核表达体系：n 对重组蛋白不能糖基化v真核表达体系：n 酵母 ：n 酿酒酵母：过度甘露糖基化。需进行改造。n 甲醇营养型酵母： Pichia pastoris; Hansenula polymorph： 与哺乳动物接近n 丝状真菌：表达异源蛋白比较困难酵母表达产物的糖型常用表达系统的糖基化差异（二）n 昆虫细胞 /杆状病毒：n 应用广泛的真核表达体系。但其生产的重组糖蛋白一般仅具有高甘露糖或寡甘露糖型糖链，难以生成复杂型糖链成为该系统的缺陷之一。n 转基因植物 ：表达哺乳动物糖蛋白具有较高免疫原性n 哺乳动物细胞：n 广泛应用的 CHO细胞株。n 具有多种糖基化突变株。n 转基因动物：n 器官专一性。n 需与乳汁中的其他寡糖分离。植物糖蛋白中复杂型 N-聚糖结构v结构的不同导致植物 N-糖链具有高免疫原性n 核心 1,3Fuc（ 哺乳动物中主要为 1,6Fuc）n 1,2Xyln 能否合成 Sia末端尚不清楚v植物的糖基化工程改造n 缺失 GlcNAcT-1基因n 敲除某些糖基转移酶n 使重组蛋白 C端带有内质网滞留信号 H/KDEL重组 rhEPO的糖基化v糖基化位点v糖链结构和功能v表达体系对糖基化的影响v培养条件对糖基化的影响v糖基化的检测与质量控制rhEPO糖基化程度的检测vSDS-PAGE（ 表观分子量）v等电聚焦电泳v高效液相色谱（ HPLC）v核磁共振（ 1HNMR）v质谱（ MS） v凝集素法 （ Lectin-binding assays for the isoforms of human erythropoietin: comparison of urinary and four recombinant erythropoietins. Journal of Endocrinology, Vol 150, Issue 3, 401-412） ：n 鸡冠刺桐凝集素 (Erythrina cristagalli agglutinin， ECA);与无唾液酸末端的具有 Gal beta1-4GlcNAc 外链的糖连结合 n 朝鲜槐白血球凝集素 (Maackia amurensis leukoagglutinin， MAL)： NeuAc alpha 2-3Gal beta 1-4GlcNAcSDS-PAGE检测 rhEPO的糖基化BACK思考v糖链在糖复合物中的功能v糖基化工程的技术和应用 基因工程技术v糖基化的检测 糖链分析方法vrhEPO 综合应用实例糖生物学第十一章 糖生物学在医药、工农业中的应用糖生物学对医药领域的启示v 医学n 早期诊断：凝集素，糖芯片v 药物设计n 抗细胞粘附：精卵结合，炎症反应n 抗感染n 抗肿瘤转移n 抗凝血n 酶替代疗法治疗糖合成和代谢酶缺陷性疾病n 酶抑制剂干扰有害糖代谢：糖尿病n 提高靶向性n 。v 农药设计n 杀真菌：干扰真菌细胞壁合成n 杀虫：干扰昆虫体内特殊糖的代谢n 激活植物自卫系统：寡糖素v 重组蛋白类药物的糖基化工程v 天然药物的糖基杂化、糖的酶法合成v 。糖生物学对医药领域的启示v寡糖类药物n 分子和细胞识别抑制剂：n 病原性微生物及毒素的抑制剂：分子小，可溶，可经呼吸道或肠道进入人体n 抗炎症药物n 精卵结合抑制剂n 免疫增强剂： -葡聚糖n 疫苗：细菌疫苗，肿瘤疫苗n 糖酶抑制剂：唾液酸酶抑制剂，阿卡波糖等v重组类糖蛋白药物n 延长体内半衰期n 提高药物的靶向性v治疗用蛋白聚糖 ：抗凝血、聚透明质酸等v器官移植急性排斥中的糖生物学v中草药活性成分 寡糖类抗感染药物v 可口服或气管给药，不需注射v 病原性微生物及毒素的抑制剂适应症（病原） 抗黏附的糖制剂 公司胃溃疡（幽门螺杆菌） 唾液酸化乳糖 Neose中耳炎（流感嗜血杆菌） 唾液酸化四糖 Neose肾衰竭（大肠杆菌毒素） Gal1-4Gal Synsorb Biotech腹泻（难辨梭菌毒素） Gal1-3Gal Synsorb Biotech腹泻（霍乱弧菌毒素） GM1 Synsorb Biotech寡糖类疫苗药物细菌的糖疫苗：如 Hib疫苗，使 Hib感染发病率下降 95%。肿瘤的糖疫苗：黑色素瘤、乳腺癌： GM2, GD2与蛋白载体缀合乳腺癌： Sialyl 2-6GalNAc -（ 唾液酸 Tn抗原）对选凝素介导的白细胞穿行的抑制：SiaLexFucTVII酶抑制剂 抑制肿瘤转移：硫酸乙酰肝素抑制剂拟糖类糖酶抑制剂药物适应症 药物（