氧化应激与心肌

氧化应激与心肌1957 年美国克里夫兰临床中心，首先将大隐静脉搭桥术应用于冠心病病人，此后冠状动脉粥样硬化性心脏病血运重建治疗快速发展。冠状动脉溶栓术、经皮冠状动脉成形术、冠状动脉支架植入术、冠状动脉旁路手术已成为挽救缺血心肌的重要治疗方式。但血流恢复本身也会引起显著的损伤，部分患者在血供恢复后，出现细胞超微结构变化、细胞代谢障碍、细胞内外环境改变，导致缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion-associated tissue injury， IRI），临床表现为心律失常、心力衰竭等。IRI 也出现在心脏手术、心脏移植、心肺复苏等临床情况后。目前研究表明细胞 IRI 的机制主要包括：氧自由基含量增多、细胞内钙超载、线粒体膜去极化等。氧化还原失衡是 IRI 发生的重要起始因素，但其机制和细胞中存在的保护机制尚不完全明确，本文重点对氧化应激与心肌 IRI 的研究进展做一综述。1.氧化应激和 ROS氧化应激（oxidative stress，OS）主要是由于内源性和(或 )外源性刺激引起机体代谢异常而骤然产生大量活性氧簇（ROS）。ROS 是指在外层电子轨道含有一个或多个不配对电子的原子、原子团或分子，包括超氧阴离子（O 2- ）、过氧化氢（H 2O2）、过氧亚硝酸盐（ONOO -）和羟基自由基（OH）。ROS 作为第二信使介导了许多生理性与病理性细胞事件，包括细胞分化、过度生长、增殖及凋亡。超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶作为体内清除自由基的重要物质，在维持体内氧化还原平衡方面发挥重要的作用。但在 IRI 过程中，参与合成 ROS 的酶体系增多，且活性更强，如 NADPH 氧化酶、线粒体黄素酶、黄嘌呤氧化酶、未偶联的一氧化氮合酶、细胞色素 P450、脂氧合酶、环氧合酶和过氧化物酶体，ROS 的生成量明显高于细胞内的清除能力，导致氧化还原失衡。ROS 虽然半衰期很短，但具有极强的氧化活性，与细胞内脂质、蛋白质、核酸等生物大分子发生过氧化反应，造成细胞结构损伤和代谢障碍。2.ROS 的主要来源NADPH 氧化酶是细胞内 ROS 的最主要来源，是由催化亚基 gp91phox 或其同系物，即非吞噬细胞氧化酶 14(NOX14) 、双功能氧化酶 12(Duox12) ，跨膜亚基 p22phox，胞浆亚基 p47phox、p67 phox 等蛋白分子共同组成的多亚基蛋白复合体。NOX 家族蛋白亚型与跨膜亚基、胞浆亚基结合并组装成有活性的复合体后发挥其生物学功能。活化的 NADPH 氧化酶复合物与 NADPH 结合并释放 2 个电子，通过黄素腺嘌呤二核苷 (FAD)传递给亚铁血红素，与细胞膜的外侧的 2 个氧分子结合生成 O2-，最后生成 H2O2、过氧化硝酸盐(ONOO-) 、羟基团(-OH) 及其它基团 1,2。NOX 源性的 ROS 在维持机体稳态中是把双刃剑，NOX 源性 ROS 一方面在氧化还原信号通路中起到了第二信使作用，参与多种细胞生理功能；另一方面，在高血压、动脉粥样硬化以及心肌 IRI 的病程中发挥了重要作用，因此单一抑制NOX 活性对治疗心肌 IRI 并不是最好的选择。Vincent 等 3研究发现在 30 分钟缺血-24 小时再灌注小鼠模型中，NOX4 基因敲除组与 NOX1 和 NOX2 敲除组相比，表现出更大面积的心肌梗死，提示内源性 NOX4 在 H/R 损伤中可能发挥着心肌细胞保护作用。黄嘌呤氧化酶（XO）是 IRI 中 ROS 产生的另一重要来源，与合成抗氧化剂尿酸的黄嘌呤还原酶（XDH）作用相反。XDH/XO 活力受细胞因子、细胞内化学物质及激素的调节。细胞缺血时 XO 活力升高，并且 ATP 分解产物次黄嘌呤积聚，再灌注时 O2 大量介入，次黄嘌呤和氧在 XO 作用下反应生成 O2- 和 H2O2。有研究指出，XO 不仅通过合成 ROS 参与心肌缺血再灌注损伤，XO 本身可以与白细胞产生相互作用，造成微循环阻塞，导致再灌注的无复流现象。此外，XO 可以直接损伤血管内皮细胞（ EC）或通过 ROS 间接损害EC，影响心肌血流再灌注 4。3.ROS 与细胞损伤氧化应激反应中 ROS 急剧增多，造成细胞内生物大分子损伤。ROS 与细胞膜的氧化反应主要是细胞膜磷脂分子中不饱和脂肪酸的过氧化，生成脂质过氧化物，再经过氧化物酶分解生成丙二醛（MDA），最终磷脂结构发生变化，生物膜受到严重损伤，细胞膜和细胞器膜的液态性、流动性降低，通透性升高，造成细胞肿胀、细胞内肌红蛋白和肌钙蛋白等大分子蛋白外渗；溶酶体膜的不稳定引起溶酶外泄，激活细胞自噬通路；内质网膜受损引起 Ca2+释放进入胞质导致细胞内钙超载，同时诱导内质网应激及其相关的凋亡通路。蛋白质的过氧化反应引起酶蛋白的失活，如线粒体内膜上与能量代谢有关的酶如细胞色素 C还原酶、柠檬酸合酶等活性下降将导致线粒体能量代谢障碍；细胞膜受体、离子通道和肌浆网钙泵蛋白的过氧化引起细胞信号通路传导功能障碍和正常生理调节功能受损。ROS 对核酸的直接攻击造成 DNA 断裂和染色体畸变。4.膜结构与氧化应激已经认识到 I/R 可以引起细胞膜磷脂的损伤，膜结构流动性和稳定性受损，膜稳定剂应用组与对照组相比，LDH、特异性肌钙蛋白（ cTnI）的释放明显减少，细胞内 Ca2+超载减弱，细胞凋亡介导因子 caspase-3 活性完全受抑 5。但细胞膜的损伤也是 IRI 的重要机制，细胞氧化应激损伤参与其中，在缺氧-复氧造成的 IRI 模型中应用膜稳定剂和应用抗氧化剂可以起到相似的细胞保护作用 5。脂筏（LR ）是鞘脂和胆固醇在生物膜上构成一种微区结构，质膜微囊（Caveolae）是脂筏的一种。它们参与信号转导和物质运输，能把激素、 生长因子及胞外调节分子的信号传入胞内，在信号转导中发挥枢纽作用。Caveolae 与内皮型细胞一氧化氮合酶（eNOS）、NADPH 氧化酶等共同形成信号平台。Caveolae 的标志蛋白陷窝蛋白-1 （Caveolin-1）通过与 NOXs、p22 连接，将 NADPH 氧化酶定位在小窝上，这些与细胞氧化应激反应相关的功能性复合物形成氧化还原信号平台。富集 Caveolin-1 的质膜微囊影响 NADPH 氧化酶的组装、移位和 ROS 介导的信号转导 6,7。通过 Caveolin-1 siRNA 敲除 Caveolin-1 可以抑制脂筏所介导的 NADPH 氧化还原信号激活 8。缺少膜胆固醇的平滑肌细胞细胞模型中，外界不良刺激诱导的 ROS 的合成和细胞增殖水平降低 9。但也有研究发现 Caveolae 不仅参与细胞的 IRI 过程，同时也起着保护作用 10。在心肌、脑、后肢缺血性损伤模型中，Caveolin-1 基因敲除小鼠与野生型相比，表现出更严重的损伤程度 11。质膜微囊的组成除 Caveolin-1 外，还有 Caveolin-2、Caveolin-3 等。Caveolin-2 具有增强质膜微囊内部结构的作用，但并不影响微囊中其他成分的表达。而在相同条件下Caveolin-3 敲除的小鼠与对照组相比，IRI 显著并出现线粒体肿胀，七氟醚、替普瑞酮等可通过此途径发挥对心肌的保护作用 12,13。5.线粒体与氧化应激线粒体参与心肌细胞 IRI 的主要机制包括 ATP 生成减少、Ca 2+过荷、ROS 大量产生及线粒体膜通透性转换孔（mPTP ）持续开放等，各机制之间相互关联、相互影响，共同介导了心肌 I/R 过程中的线粒体功能障碍，最终导致细胞凋亡、组织损伤。线粒体不仅是 ROS介导细胞氧化损伤的主要靶点，也是 ROS 产生的重要位点，再灌注损伤是造成线粒体ROS 生成的重要原因之一。线粒体电子传递链是 ROS 生成的重要来源，生理状态下，线粒体中的呼吸链利用分子氧进行氧化磷酸化产生 ATP，但在心肌 IRI 过程中，由复合物I、II、III、IV 及电子载体组成的电子传递链，其完整性遭到破坏，复合物 I、III 成为 ROS电子来源，如复合体 III 的 Q 循环中 Q0 位点中半醌自由基 (UQH)是 O2- 的单电子来源，还原细胞色素 C（Cyt-C ）是生成 H2O2 的双电子供体。线粒体呼吸链产生的 O2- 和 H2O2构成生物体内最大数量 ROS 的恒定来源。过量产生的 ROS 损害线粒体的膜系统，影响线粒体膜两侧的质子梯度，引起膜结构蛋白质和脂质过氧化，膜通透性增加，电子传递链活性的进一步下降，形成恶性循环，最终造成线粒体破裂 14,15。虽然线粒体电子传递链上ROS 生成的具体位点尚有争议，但呼吸链电子传递受阻仍然是呼吸链大量生成 O2- 和H2O2 等 ROS 的必要条件。生理情况下线粒体通透性转换孔（mPTP）具有间断性开放的功能，维持线粒体基质与外室之间的物质平衡，但在持续氧化应激、ROS 过量蓄积、Ca 2+超载的情况下，mPTP 不可逆性持续开放。mPTP 的开放一方面引起线粒体内外离子平衡失调，线粒体膜电位( m)迅速下降，线粒体肿胀，ATP 耗竭，甚至细胞死亡。另一方面，mPTP 的开放会导致 Cyt-C 释放进入胞浆，启动 caspase 级联凋亡反应，最终引起细胞凋亡。但 Abdallah Y等的研究提示，在 I/R 中，线粒体内 Ca2+超载是 mPTP 不可逆开放的原因，ROS 过量生成是 mPTP 开放后的一种结果。总之，mPTP 开放、线粒体功能障碍、氧化应激相互影响，构成心肌细胞 IRI 的重要机制 16,17。线粒体 DNA（mtDNA）缺乏结合蛋白的保护和完善的损伤修复系统，直接暴露于氧化磷酸化过程中产生的高反应性氧中，氧化损伤是 mtDNA 突变的主要原因。心肌 I/R 中，ROS 过量生成，致使核酸分子发生过氧化反应且无法修复，相应结构蛋白组分表达缺失，又将引起呼吸链中断，膜电位崩溃，ATP 合成受阻，ROS 生成增多，形成恶性循坏直至线粒体崩解，细胞凋亡、坏死。Yue R 等 18研究证明番茄红素可保护 IRI 诱导的心肌细胞mtDNA 氧化损伤。 6.细胞核与氧化应激细胞核膜也是细胞膜结构的一种，将真核细胞的细胞核和细胞质隔离开来。附着在细胞核膜上的核三磷酸核苷酶（NTPase）为核质物质交换提供能量，脂质过氧化反应抑制NTPase 活性， mRNA 和蛋白多肽的转运受到影响 19。心肌细胞中的肌球蛋白除参与心肌细胞收缩以外，位于细胞核中的肌球蛋白还可以作为一种核转录因子，肌球蛋白调节轻链（MLC20 ）能够与 NOX2 基因启动子上游靶序列结合，调控 NOX2 的表达 20。脑组织 IRI 模型中，肌球蛋白调节轻链激酶（ MLCK）上调MLC20 的磷酸化水平，增加 NOX2 和 NOX4 的表达，促进 IRI 中的氧化应激反应，MLCK的特异性抑制剂 ML-7 抑制上述反应的发生，与 NOX 抑制剂 DPI 具有相似的细胞保护效应 21。细胞核对于氧化应激反应具有一定的保护能力，如沉默信息调节因子 1（Sirt1）。Sirt1 是 Sirtuins 家族成员之一，具有相当高的 NAD+ 依赖性组蛋白脱乙酰化酶的活性。Sirt1 主要位于细胞核中，在氧化应激中 Sirtl 表达上调，作用于 FoxO 家族成员，保护心肌细胞免于氧化应激损伤。此外，Sirtl 可以通过去乙酰化作用抑制 P53 的活性而保护细胞免受凋亡，对 PGC-1 的去乙酰化作用提高体内抗氧化酶的水平，对于细胞氧化还原稳态的维持起到重要的作用 22,23。7.氧化应激与几种信号通路氧化应激造成心肌细胞 IRI 的机制一直是研究的热点，目前已探明的细胞内信号通路包括以下几个：Yanmei Zhang 等 24在缺氧-复氧诱导的 H9c2 细胞模型中，ROS 清除剂依达拉奉降低 JNK 活性和 Egr-1 的表达水平，JNK 抑制剂 SP600125 抑制 Egr-1 的表达，并且对 Egr-1 蛋白表达水平的抑制作用呈剂量依赖性，实验证实在细胞 IRI 中存在 ROS / JNK / Egr-1 通路，并指出 N-正丁基氟哌啶醇通过抑制此通路保护细胞。Li C 等 25在相同的细胞模型中，以 SP600125 和 SB203580（P38 抑制剂）分别作用于细胞，检测 JNK、p38MAPK表达，证实两者之间存在级联关系，并能够影响凋亡相关蛋白 BCL-2、Bax 及 caspase-3 的表达，槲皮素通过抑制此通路保护 IRI 中的细胞。Ma L 等 26用氧气-葡萄糖剥夺（OGD）的方法诱导 IRI 模型，ROS 、 JNK、NF-B 的表达均上调，应用 SP600125 后细胞凋亡和NF-B 信号传导途径均受到抑制，人参提取物人参皂苷 Rb3 能通过抑制 ROS/JNK/NF-B通路在细胞 IRI 中起保护作用。在了解心肌 IRI 机制的基础上，研究人员致力于阻断损害通路、明确细胞自身保护通路的研究，为缺血性心脏病的治疗提供基础研究支持。Li H 等 27研究发现在 IRI 的组织中除氧化应激反应增强，Bcl-2、caspase-3 和 caspase-9 的表达上调，还出现 PI3K、Akt 和GSK-3 的表达受抑现象。已证明 H2S 对心血管系统具有保护作用，但 LY294002（PI3K特异性阻滞剂）能够阻断 H2S 对心肌 IRI 的保护作用，研究结果表明 H2S 通过上调PI3K/Akt/GSK-3 通路相关蛋白表达保护心肌。Zhang M 等 28对两组小鼠心脏组织进行缺血再灌注处理，其中一组为 Notch3 siRNA 处理组，与对照组比较发现 Notch3 通过激活Akt 通路防止心肌 IRI，抑制心肌细胞凋亡，抑瘤素 M（ OSM）通过 O 受体诱导的细胞保护作用通过激活这一通路起作用。总之，细胞中的膜结构、细胞器、细胞核在心肌 IRI 中均有参与，目前研究已明确多种药物能够通过抑制细胞内氧化应激反应防治 IRI。但氧化应激信号在细胞生长、增殖等正常生理活动中具有重要的信号传导作用，对氧化应激反应的完全抑制不利于心肌组织的正常工作。因此进一步明确损伤性 ROS 合成途径、作用通路及细胞内存在的保护机制，有利于选择性抑制 IRI 中的氧化应激，为其临床应用提供理论基础和研究方向。参考文献：1 韩晓燕，高丽萍，刘箐. 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