流动注射化学发光

流动注射-化学发光联用技术用于药片中的盐酸环丙沙星含量的研究摘要 本实验采用利用盐酸环丙沙星对 Ce（IV）-Na 2SO3 化学发光的增敏作用实现流动注射-化学发光联用技术用于药片中的盐酸环丙沙星含量研究，优化浓度后的流路设计为将浓度为 5.010-3mol/L 的 Na2SO3 溶液与盐酸环丙沙星溶液充分混合后，加入 5.010-4mol/L 的 Ce4+ 进行发光检测。实验测得线性回归方程 y = 1704.83x + 377.32 （R2 = 0.9902），测得盐酸环丙沙星浓度为 1.32mg/L。经检验，本检测方法的检出限为 0.08001mg/L，相对标准偏差为 2.75%。关键词 流动注射法 化 学 发 光 盐 酸 环 丙 沙 星 标 准 校 准 曲 线 法 条 件 优 化1 引 言盐 酸 环 丙 沙 星 属 于 第 三 代 喹 诺 酮 类 药 物 ， 抗 菌 能 力 强 ， 临 床 广 泛 应 用 于 革 兰 氏 阳 性 菌 和 革 兰 氏 阴 性 菌 引 起的 感 染 ， 对 -内 酰 胺 抗 生 素 、 氨 基 糖 苷 类 以 及 四 环 素 等 多 重 药 菌 具 有 较 好 的 抗 菌 活 性 1。目 前 ， 盐 酸 环 丙 沙 星 的 测 定 方 法 有 很 多 ， 主 要 有 HPLC2、 电 位 法 3、 比 色 法 4、 毛 细 管 电 泳 法 5、 分 光 光度 法 6等 。 然 而 ， 这 些 方 法 往 往 存 在 仪 器 昂 贵 ， 操 作 复 杂 ， 测 量 耗 时 较 长 等 问 题 。在 碱 性 介 质 中 ， 环 丙 沙 星 对 鲁 米 诺 -KIO4-Co2+ 反 应 体 系 产 生 的 化 学 发 光 明 显 地 受 到 抑 制 ， 且 化 学 发 光 强度 的 抑 制 强 度 与 环 丙 沙 星 的 浓 度 成 正 比 关 系 。 在 酸 性 条 件 下 ， 盐 酸 环 丙 沙 星 对 Ce（ IV） -Na2SO3 微 弱 化 学 发光 体 系 具 有 很 强 的 增 敏 作 用 ， 据 此 ， 建 立 了 流 动 注 射 化 学 发 光 法 测 定 盐 酸 环 丙 沙 星 的 新 方 法 7。 相 对 于 其 他 检测 方 法 ， 化 学 发 光 由 于 不 需 要 外 来 光 源 而 消 除 了 背 景 光 的 干 扰 ， 大 大 提 高 了 检 测 精 度 。 相 对 于 传 统 注 射 技 术 ，流 动 注 射 技 术 不 仅 具 有 低 消 耗 高 效 率 的 优 点 ， 而 且 适 应 性 广 泛 且 测 量 精 度 高 。 流 动 注 射 -化 学 发 光 联 用 技 术 由于 其 操 作 简 单 快 速 、 高 精 度 和 高 效 率 等 优 点 而 在 化 学 分 析 领 域 具 有 广 泛 的 应 用 8。本 实 验 采 用 流 动 注 射 -化 学 发 光 联 用 技 术 测 定 指 定 盐 酸 环 丙 沙 星 药 片 中 盐 酸 环 丙 沙 星 含 量 ， 对 实 验 条 件 优化 后 ， 通 过 检 测 其 检 出 限 和 相 对 标 准 偏 差 评 估 该 实 验 的 准 确 性 。 实 验 证 明 本 方 法 高 灵 敏 度 和 较 宽 的 动 态 范 围 ，仪 器 简 单 ， 操 作 简 捷 ， 结 果 准 确 可 靠 。2 实验部分2.1 仪器与试剂2.1.1 仪器BPCL 微弱发光测量仪（中国科学院生物物理研究所）；HL-2D 恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）；八通阀（杭州）；联机计算机。2.1.2 试剂硫酸铈溶液：4.010 -4 mol/L（用0.05 mol/l 硫酸溶解）；亚硫酸钠溶液：8.010 -2 mol/l；盐酸环丙沙星标准溶液：100.0 mg/L(用 0.04 mol/l 盐酸溶解)；盐酸环丙沙星滴眼液。所用试剂均为分析纯，所用水为二次蒸馏水。2.2 仪器预热1) 接通计算机电源，启动 windows 系统；打开 BPCL 主机电源，仪器预热 30min 以上，选择所需温度及负高压。打开快门开启BPCL测量程序，设定参数后启动测量。2) 清洗流路：开启蠕动泵，旋紧蠕动泵上面及两侧的4个旋钮，选择蠕动泵转向，打开蠕动泵，选择流速（可以用 60rpm ）。按图1组装流路，用 0.1mol/L 硝酸清洗流路，而后用 0.1mol/L NaOH 清洗流路，最后用二次蒸馏水清洗，直到基线稳定（当副高压为 -750V 时，基线在 100 单位化学发光信号为合适）。2.3 数据测量1) 用 100.0mg/L (用 0.04 mol/L 盐酸溶解)的盐酸环丙沙星储备液，配置浓度为 0.1-10mg/L 的盐酸环丙沙星标准溶液系列。2) 标准曲线的绘制：按图一流路测量，启动泵（流速为 60rpm ），将 Na2SO3 溶液与盐酸环丙沙星溶液混合后，通过流动泵注入作为载流的酸性硫酸铈溶液中，微弱发光仪检测及纪录发光强度信号。重新启动测量程序，开始检测。首先测量空白溶液，按相同时间间隔（15s）旋转八通阀，得到信号峰，平行测量三次，标准系列由稀到浓进行测量，操作同空白，得到一条时间-峰值图，完成检测后选择停止流动注射-化学发光联用技术用于药片中的盐酸环丙沙星含量的研究 仪器分析实验 2013-063检测，保存，导出为 .txt 或 .Xls 文件后，导入 origin 处理。绘制浓度 -峰值标准曲线，线性拟合得浓度-峰值关系式。3) 盐酸环丙沙星滴眼液（规格 5ml：15mg（按环丙沙星计）湖北东盛制药有限公司），按标示稀释为10mg/L 的浓度，按（2）操作先走空白，空白的峰值和标准曲线相近，测量理论浓度为 10mg/L（按环丙沙星计）的药片，均平行测量三次，完成检测后选择停止检测，保存，导出为 .txt 或 .xls 文件后，导入 origin 处理。读出峰值，按浓度-峰值关系式求出药片中的实际盐酸环丙沙星含量。2.4 清洗流路1) 清洗流路（同上面方法，最后将管中二次蒸馏水全部走光，保证管不被腐蚀），关闭快门旋松蠕动泵旋钮，关闭 BPCL 主机。2) 关闭电脑，洗净试剂瓶，容量瓶，清洁台面，关闭实验室电源方可离开。3 结果与讨论3.1 动力学曲线本实验设计了四种流路（表1）并分别得到四条动力学曲线（图 1）。表 1 流路设计序号 流路设计 实验结果（1） 先使 Ce 4+ 溶液与 Na 2SO3 溶液充分混合后，再迅速加入50L 盐酸环丙沙星溶液没有明显的发光信号（2） 先使 Na 2SO3 溶液与盐酸环丙沙星溶液充分混合，再加入50L Ce 4+ 溶液一个约 2500 强度的发光信号（3） 在 Ce 4+ 溶液中加入 50L Na 2SO3 溶液与盐酸环丙沙星溶液的混合溶液一个约 300 强度的发光信号（4） 先按一定倍数稀释 Ce 4+ 溶液，再加入 50L Na 2SO3 溶液与盐酸环丙沙星溶液的混合溶液一个约 2500 强度的发光信号和若干较弱发光信号动力学曲线（1） 动力学曲线（2）动力学曲线（3） 动力学曲线（4）图 1 动力学曲线3.2 流路设计与装置连接由以上动力学曲线可知，化学发光来源于 Ce4+ 溶液与 Na2SO3 溶液反应，且 Ce4+ 本身的颜色会产生自吸现象。综上所述，本实验采用流路（2），其动力学曲线如下（图 2）。图 2 流路 2 得到的动力学曲线流动注射-化学发光联用技术用于药片中的盐酸环丙沙星含量的研究 仪器分析实验 2013-065流路设计和装置示意图如下（图 3）。P. 蠕动泵； V. 十六通阀；F . 流动池； M. 混合三通 ； W. 废 液 ； PMT. 光电倍增管；HV. 负 高 压； PC. 联机 电 脑；a：Na 2SO3 溶液； b： 盐 酸 环 丙 沙 星 溶 液 ； c： 硫 酸 铈 铵 溶 液图 3 流动注射-化学发光系统示意图3.3 体系条件优化3.3.1 硫酸铈浓度的影响固定 Na2SO3 浓度为 810-4 mol/L，流速 60 rpm，分别在空白和 10 mg/L 标样的条件下考察 Ce4+ 溶液浓度在 110-5 510-3 mol/L 范围内变化对体系信号的影响。图 4 硫酸铈浓度优化的时间-发光强度关系将上图数据整理记录于表2，绘制相对发光强度 I - Ce4+ 浓度关系图（图 5）。表 2 相对发光强度与 Ce4+ 浓度关系c（Ce 4+）/molL-11.010-5 5.010-5 1.010-4 5.010-4 1.010-3 2.510-3 5.010-3发光强度 I 空白 343 667 710 368 307 283 263发光强度 I 环丙沙星363 1855 10121 14823 3635 1143 305发光强度 I 相对 20 1188 9411 14455 3328 860 42图 5 相对发光强度 I - Ce4+ 浓度关系图由图5可判断，最优 c（Ce 4+）为 5.010-4 mol/L，此时体系发光强度最大。3.3.2 Na2SO3浓度的影响固定 Ce4+ 浓度为 5.010-4 mol/L（含硫酸浓度 0.05 mol/L），流速 60 rpm，分别在空白和 10 mg/L 的条件下考察 Na2SO3 在 1.010-4 1.010-1 mol/L 范围内变化时对信号值的影响。流动注射-化学发光联用技术用于药片中的盐酸环丙沙星含量的研究 仪器分析实验 2013-067图 6 亚硫酸钠浓度对发发光强度的影响数据记录于表3，并绘制出相对发光强度 I-Na2SO3 浓度 c 关系图。表 3 亚硫酸钠浓度对发发光强度的影响c（Ce 4+）/molL-11.010-4 5.010-4 1.010-3 5.010-3 1.010-2 5.010-2 1.010-1发光强度 I 空白 339 437 441 1244 1245 1054 1061发光强度 I 环丙沙星3739 13804 13585 19597 9850 2768 1493发光强度 I 相对 3400 13367 13144 18353 8605 1714 432图 7 相对发光强度 I-Na2SO3 浓度 c 关系图由图7可判断，最优 c（Na 2SO3）为 5.010-3 mol/L，此时体系发光强度最大.3.3.3 校准曲线、精密度和检出限在选定的最佳条件下，测量相对发光强度与盐酸环丙沙星浓度在 0.10 mg/L 15 mg/L 范围的关系，作出线性关系图，拟出回归方程。图 8 线性相关浓度范围表 4 标准溶液测定结果c样品/mgL0 0.10 0.30 0.50 0.80 1.0 3.0 5.0 8.0 10 12 15实测发光强度 I1338 1437 1885 2332 2958 3408 6722 11034 16770 20235 21760 25664相对发光强度 I0 99 547 994 1620 2070 5384 9696 15432 18897 20422 24326根据上表数据绘制盐酸环丙沙星标准校正曲线如图9，线性方程为：y = 1704.83x + 377.32 R2 = 0.9902 （1）流动注射-化学发光联用技术用于药片中的盐酸环丙沙星含量的研究 仪器分析实验 2013-069图 9 标准校准曲线对 5.000mg/L 盐酸环丙沙星平行测定 11次，数据记录于表5 。表 5 空白样和标准溶液的相对发光强度次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11空白样品I 空白1177 1178 1134 1174 1133 1198 1243 1211 1219 1279 1238标准溶液I 11924 11714 11600 12603 12469 12518 12336 11891 12099 12316根据 IUPAC 建议计算方法，计算出该方法的检出限为：DL = 3/S = 0.08081mg/L舍去一个实验操作导致的异常值，相对标准偏差 R.S.D = 2.65%.3.4 样品测定取盐酸环丙沙星片剂用二次蒸馏水稀释为不同的浓度，平行测定空白与样品溶液的发光强度，数据记录与表6。表 6 样品含量测定数据测定次数 1 2 3空白 I 1323 1257 1251样品 I 3450 4331 3919相对发光强度 I 2127 3074 2668样品浓度（mg/L） 1.03 1.58 1.34样品平均含量（mg/L） 1.32将所测数据代入方程（1），计算得盐酸环丙沙星的浓度 c = 1.32mg/L。3.5 讨论本实验在配制标准溶液时，由于浓度较小进样量较大，为了保证精确度又使标准溶液足够使用，因此采用隔开一个浓度的逐级稀释方法配制标准溶液。在测动力学曲线时，流路设计（4）中出现多个较弱发光信号的原因可能是加入 50L Na2SO3 溶液与盐酸环丙沙星溶液的混合溶液时速度较慢，造成溶液分多次加入。本实验的线性回归方程相关系数不太理想，可能是由于化学发光体系本身精密度的限制和配制标准溶液时差生较大误差导致。中途更换十六通阀的操作者，可能对整个实验的精确度产生一定影响。4. 结论本实验采用流动注射-化学发光联用分析法，优化浓度后的流路设计为将浓度为 5.010-3mol/L 的 Na2SO3 溶液与盐酸环丙沙星溶液充分混合后，加入 5.010-4mol/L 的 Ce4+ 进行发光检测。实验测得线性回归方程 y = 1704.83x + 377.32 （R 2 = 0.9902），测得盐酸环丙沙星浓度为 1.32mg/L。经检验，本检测方法的检出限为 0.08001mg/L，相对标准偏差为2.75%，表明该方法操作简便迅速，测定结果准确可靠。参 考 文 献1 唐 玉 海 , 姚 宏 , 孙 媛 媛 . 流 动 注 射 抑 制 化 学 发 光 法 测 定 盐 酸 环 丙 沙 星 J. 理 化 检 验 （ 化 学 分 册 ） , 2007， 08:639-641.2 李 章 万 , 敦 平 , 敦 群 . 药 物 分 析 杂 志 , 1994, 14（ 2） ： 16-18.3 修 荣 , 黄 超 伦 , 王 伟 , 潘 振 华 . 酸 碱 双 点 电 位 法 测 定 盐 酸 环 丙 沙 星 的 含 量 J. 分 析 化 学 学 报 , 2005, 03:351-352.4 唐 湘 红 , 徐 浩 嘉 , 屠 婕 红 . 比 色 法 测 定 盐 酸 环 丙 沙 星 片 含 量 . 现 代 应 用 化 学 , 1993 年 06 期 ： 38-39.5 曾 海 虹 , 邱 涵 , 陈 素 俭 . 高 效 毛 细 管 电 泳 测 定 盐 酸 环 丙 沙 星 的 含 量 . 海 峡 要 学 , 2001 年 第 13 卷 第 3 期 ： 51-52.6 Sutan S M, 周 执 中 . 流 动 注 射 分 光 光 度 法 测 定 制 剂 中 的 环 丙 沙 星 J. 国 外 医 药 抗 生 素 分 册 , 1994, 15（ 3） ： 1752178.流动注射-化学发光联用技术用于药片中的盐酸环丙沙星含量的研究 仪器分析实验 2013-06117 梁 耀 东 , 李 建 中 , 章 竹 君 . 流 动 注 射 -化 学 发 光 法 测 定 盐 酸 环 丙 沙 星 . 分 析 化 学 , 1997 年 11 月 第 25 卷 第 11 期 ： 1307-1310.8 田 进 军 , 薛 艳 . 流 动 注 射 -化 学 发 光 分 析 法 应 用 研 究 进 展 J. 分 析 测 试 技