淡水藻类及藻类毒素研究进展

淡水藻类及藻类毒素研究进展徐立综述徐顺清审阅藻类是水环境中的初级生产者，对维持水环境的生态平衡起着举足轻重的作用。首先，它们通过光合作用为水中生物提供氧气;其次，它们可分解水生生物的代谢产物及水环境中的有机物质，而成为水环境中的清洁工;另外，由于许多藻可以固氮或含有丰富的营养，可作为水生生物的优良饵料。然而近些年来，随着工农业生产的迅速发展和城市规模的扩大，大量工业污水和生活污水排入水体，使天然水体的富营养化日益严重。富营养化的重要特征是在夏季高温时期藻类大量滋生，形成绿色丝带状的水华，漂浮在水面影响水环境的美观。藻类的比重在 1 左右，蓝藻中的微囊藻细胞内具有气囊，它的比重小于 1，多漂浮在水面上，外有衣胞包裹，呈絮团状，其它种类的藻类多悬浮在水体中。形成水华的某些蓝藻是有毒的，大量藻类死亡后被水中异养菌分解，产生恶臭进一步释放体内毒素，将严重恶化水质。长期低浓度藻毒素的摄入会对人体造成危争。目前，淡水藻类污染己成为全球范围内日益严峻的环境和公共卫生问题，各国学者围绕该问题开展了很多极有意义的研究工作，涉及生态学、毒理学等各个方面。1.藻类污染的生态学研究1.1 藻类的生态藻类植物是地球上最重要的初级生产者。它们合成的有机碳总量是高等植物的 7 倍。全世界藻类植物约有 40000 种，其中淡水藻类约 25000 种左右，而中国己发现的淡水藻类约9000 种。包括:原生动物们的蓝藻们，原生动物门的硅藻门、甲藻门、金藻门、黄藻门、隐藻门、裸藻门以及属于植物界的红藻门、褐藻门、绿藻门和轮藻门。淡水藻类在自然界里的分布非常广泛，适应性很强，对环境条件的要求不很严格，就是微不足道的营养和只有微弱的光照强度以及较低的温度下也能得到满足。淡水藻类中大多数的种类是水生的，包括浮游的和底栖的各种类群，分布于不同水体中。静止绿色的池塘和水坑中都含有大量的单胞藻。其中最常见的有绿藻类的栅藻属、盘星藻属等种类。随着数量的多少而决定水色的深浅，呈现黄绿或浓绿。但藻体微小，肉眼无法辨认，显微镜下可见其形态。在淡水河流与湖泊中，也有大量藻类生长，主要是硅藻类的小环藻属、直链藻属，蓝藻类的颤藻属，绿藻类的衣藻属、小球藻属、新月藻属或栅藻属以及纤维藻属的种类，这些藻类多数生活于富含有机质的水中。小环藻属、直链藻属、颤藻属、绿球藻属，栅藻属等多生长于污化程度较弱的水体，而衣藻属、棵藻属等多生长于污化程度较高的水域。根据它们的分布情况，可以作为水质污染度的指示植物。1.2 藻类生态学的研究内容本世纪 70 年代以前，藻类污染生态学的研究己经开始，但水污染对藻类影响的研究成果报道不多。外国藻类学家的主要兴趣在于寻找被生活污水污染的水体的指示藻类，并且巳开始利用藻类氧化塘作为二级处理去除 N、P 的研究.70 一 90 年代，藻类污染生态学研究取得了较大的发展。水污染对藻类的影响研究主要表现在受害阈值及致死剂量的确定;富营养化对藻类影响的研究主要表现在藻类种群结构的变化。关于指示藻类的研究，国内外学者不断通过实验来寻找优化工业废水的指示藻类。在用藻类来净化污水方面，不断完善藻菌共生系统，因地制宜，出现了许多效率较高的净化系统。目前藻类污染生态学的研究主要集中在水污染对藻类的影响，水污染的藻类净化及水污染的藻类监测三方面。水污染主要是重金属，富营养化和有机污染对藻类的影响。水污染的藻类净化是另一研究热点，由于藻类本身对污染具有一定的适应能力，因此可以利用藻类来处理污水。目前国内外对于用生物学技术进行污废水处理正深入研究。其中利用藻类净化水质常用的是氧化塘和藻类转盘法。藻类监测主要是利用指示种类，指数，群落结构和功能，体内残毒量等。有的藻类只能生活在水质清洁的地方，是生态环境的重要监测指标，如墨形角藻变种和粘质园绿鼓藻。有的藻类有毒或有味，成为饮用水生产过程中的重要的净化因素，如蓝藻、硅藻等。1.3 发展趋势藻类污染生态学是一门比较年轻和富有活力的学科，它在治理环境污染和监测水质方面已显示出较大的优势。随着社会的不断发展，藻类对人类的生活和生产的作用显得越来越重要。而藻类的多样性直接受水污染的影响，所以今后要继续进行藻类的毒理性试验及水污染对藻类群落的影响研究，从而找出水污染对藻类影响的规律，从而有效的控制污染。尤其要开展水污染对海洋和湖泊中的藻类的影响研究。用藻类净化水质，这是藻类污染生态学的重要研究领域。过去这方面的研究主要银中在氧化塘和藻类转盘上，今后应在废水的生化处理技术中接种高效应的对应的藻类种类，做到废水在排放之前就解决污染问题，这才是控制水污染的根本途径。水污染引起水体理化条件的变化，这种变化直接影内到水中的藻类及其它生物。经大量试验发现，有些藻类对污染很敏感，有些则有较大的忍耐力，还有的则只生活在污水中。根据藻类的种类和数量，生理、生化反应和对毒物的积累特点，可以较准确地估定水体的污染性质和程度，所以用藻类监测和理化监测相结和的方法来监测水质己成为趋势。水污染的藻类测试对于监测水环境质量变化，确定单项毒物作用下的安全浓度，观察多种毒物联合作用下的毒性变化，制定毒物或工业废水排放标准等有重要价值。2.藻类污染的毒理学研究淡水浮游藻类的污染是全球性的，由富营养化的加剧而引起有害藻类水华的频繁发生，己经成为一个世界关注的环境卫生问题，其中蓝藻水华是淡水水体中危害最严重的一类。蓝藻广泛分布于世界各地，是目前己知毒性最高，对人类健康危害最大的藻类，产生的蓝藻毒素按作用类型可分为肝毒素、神经毒素、皮肤毒素和其它毒素。微囊藻毒素(Microcystins，简写为 MC)是常见的环肤类肝毒素，由于其毒性较大，分布广泛，是目前研究较多的一族有毒化合物。可产生微囊藻毒素的淡水蓝藻(Cyanobacteria)主要有铜锈微囊藻(Mi。rocystisaerugj 。osa) ，此外其它种类微囊藻如绿色微囊藻(M.viridis)、惠氏微囊藻(M.wosenbergii)以及鱼腥藻属(Anabaena)、念珠藻属(No stoc)、颤藻属(Oscillatoria) 和节球藻属(Nodularia)的一些种或株系也能产生这类毒素。我国近年的调查显示:除了“三湖”(滇池、太湖、巢湖)已出现严重污染，长江、黄河中下游许多水库、湖泊也检测出微囊藻毒素，并己对人群健康构成潜在危害，引起广泛关注。因此，目前藻污染的毒理学研究主要集中在微囊藻毒素上。2.1 微囊藻毒素的性质2.1.1 微囊藻毒素的分子结构微囊 藻 毒 素是单环七肤肝毒素，由 1 位置的 D 一丙氨酸，2 和 4 位置的 2 个不同 L 一氨基酸，6 位置的 D 一谷氨酸，另外 3 个不寻常氨基酸即 3 位置的 D 一赤一日一甲基天冬氨酸(MasP)，5 位置的 3 一氨基一 9 一甲氧基一 2，6，8 一三甲基一 10 一苯十基一吸，6一二烯酸(Adda)，7 位置是 N 一脱氢丙氨酸(Mdha)。由于位置 2 和 4 的 2 个 L 一氨基酸的不同及 Masp 和 Adda 的甲基化 /去甲基化产生的差异，可以形成多种不同的异构体。目前己从不同微囊藻藻株中分离、鉴定了近 60 种微囊藻毒素结构。但可商品购买的只有 MC一 LR、MC 一 RR、MC 一 YR 等数种。最近 Grach 一 Pogrebinsky.0 等从斯洛文尼亚 Bled湖中又发现两种新的 MC 一 RR，并用 NMR 技术和 ES 工 MS/CID/MS 对其结构进行推导。可见探寻新的微囊藻毒素类型，并研究其结构与毒性的关系，是当前微囊藻毒素研究的一个重要方面。从微囊藻毒素的分子结构可看出(图 1)，由于环状结构和间隔双键，所以具有相当的稳定性。MC 一 LR 是第一个得到化学鉴定的微囊藻毒素，分子量大约 1000 道尔顿，目前微囊藻的相关研究大多以此为研究对象.2.1.2 微囊藻毒素的产生微囊藻毒素是细胞内毒素，它在细胞内合成，细胞破裂后释放出来并表现出毒性，目前的研究认为它不在核糖体合成，而是由肚合成酶复合体合成的生物活性小肤。有趣的是，同一种类的天然水华不一定有相同的毒性，而且给定种类的蓝藻在一段时间内的毒性也不同。一次水华的毒性是不确定的，因为毒素的浓度在短时间内会发生变化，且受水体空间条件的影响。现有研究表明，蓝藻细胞中微囊藻毒素的含量与水体 PH 值、温度、光照、营养盐浓度等环境因子有关。此外，微量元素对微囊藻毒素合成的影响，也是需要探讨的问题。RivasseauC 等对 MC 一 LR 在细胞中和在 M.a.cc78O6 培养基中的含量变化记录五周，发现毒素产量与生物量没有明显关联性，但依赖于生长期，含量在对数生长期末达到最高，且水中 MC 的释放只要出现在成熟的培养物。随着人们对细胞内复杂生化反应及其基因控制等知识的积累，微囊藻毒素的生物合成将是令人兴奋的研究内容。2.1.3 微囊藻毒素的毒性微囊藻毒素虽然主要存在于藻细胞中，但研究表明藻细胞死亡解体后，不断有藻毒素释放到水体，对人类的生活饮用水源造成危害。MC 性质非常稳定，易溶于水，如 MC 一 LR的溶解度大于 1g/L，它主要以水相存在，较少吸附于沉积物或悬浮颗粒物。对于以混凝、沉降、过滤为主要工艺的水处理而言，要去除 MC 是非常困难的。此外 MC 具有热稳定性，加热煮沸(水浴 100，30 min)不致丧失毒性。表 1 列举近 30 年蓝藻毒素引起的人类中毒事件。微囊藻毒素专一性地作用于肝脏，是极强的促肿瘤剂，能引发严重的肝内出血和肝坏死。流行病学研究表明，某些地区的肝癌高发率与饮用水源中的水华大量发生有关。人们直接接触含有毒素的水华，如在湖泊、河流、水库中进行游泳等娱乐活动，会引起皮肤、眼睛过敏，发烧，疲劳以及急性肠胃炎，如果经常暴露于含有毒素的水体，会引发皮肤癌、肝炎及肝癌。2.2 微囊藻毒素的检测方法和限值微囊藻毒素的检测一直备受重视，现在己发展了多种分析方法，主要有生物分析法、化学分析法和生化分析法。传统的生物分析法通常用小鼠腹腔注射或口腔灌喂评价微囊藻毒素的毒性。用纯化的微囊藻毒素或水华蓝藻中粗提藻毒素进行测试，根据其生理病变及半致死量可初步确定其毒性，这也是毒理评价的常用方法。这类方法操作简单，但灵敏度较差，且无法确定毒素类型及结构。化学分析法主要包括薄层色谱、气相色谱、液相色谱、毛细电泳等现代分析测试手段。这些方法利用微囊藻毒素的物化性质结合灵敏的光电技术对其进行定性、定量分析。高效液相色谱是目前应用、研究最多的方法。这一方面取决于微囊藻毒素本身的物理和化学性质，另一方面也因为该法有良好的灵敏度(可达 0.1ug/L)和选择性。其步骤是先将水华蓝藻的毒素提取液或实际水样通过固相萃取吸附法富集，溶剂淋洗后将净化的微囊藻毒素洗脱，用于定性分析。用于色谱分析。同时，可利用液相色谱的特点，与质谱或核磁共振联用确定其分子式和结构。最近又发展了毛细电泳(CE)法。后者分析速度快、具有柱上富集功能并应用激光诱导荧光检测器提高灵敏度。此外，同生化检测法相比，CE 易于实现自动化，避免了放射性物质。生化分析法有酶联免疫法蛋白磷酸酶抑制法。这是近 10 年研究发展的高灵敏度方法。酶联免疫法由于具有灵敏、快速、简单、便携、易用、适用现场分析等特点，显示出良好的发展趋势。但目前对于商品化微囊藻毒素酶联免疫测试试剂盒的应用效果还需进一步评价。蛋白磷酸酶抑制法则是利用微囊藻毒素对荧光物质蛋白磷酸酶 1(PPA1)和 2A(PP2A)的禁阻效应进行定量分析，检测限可达 0.012一 0.177ug/L。由于微囊藻毒素的危害性，世界各国对此十分关注，世界卫生组织推荐的基准值为微囊藻毒素一 LR 在水体中的浓度不超过 1ug/L，高于这一浓度对人体有害。我国的生活饮用水卫生规范(2001)将微囊藻毒素一 LR 列为检测项目，其参考限值也是lug/L。2.3 微囊藻毒素的分子生物学研究随着分子生物学实验技术的迅速发展，应用分子方法对蓝藻分类，产毒基因，遗传型，转录水平等方面的研究日益兴起和深入。 由于微囊藻是一种产毒蓝藻，且毒素危害性很大，因而与产毒相关的微囊藻毒素合成的基因构成与功能研究备受关注。微囊藻毒素是由许多蓝藻产生的肝毒性小肽，它不在核糖体合成，而是由 Mcy 基因群编码的多功能合成酶复合体合成。NIShizawa T 等通过 southern 杂交和部分 DNA 序列分析研究六个产 MC 和两个不产 MC 的微囊藻株，结果表明产 MC 的株中含有 Mcy 基因，不产 MC 的株可分为两组，有Mcy 基因和没有 Mcy 基因的两组。初步研究表明，特殊的多肤合成酶基因 McyB 仅存在于产毒微囊藻藻株中，随着研究的深入，许多产毒蓝藻的微囊藻毒素合成酶基因序列己测知， 这使得设计引物和探针来鉴定环境中的产毒藻株成为可能。潘卉、宋立荣等用PCR 技术鉴定蓝藻培养物、野外水样、沉积物样品中产毒和非产毒微囊藻藻株，PCR 扩增结果确认藻株的毒性与传统方法（HPLC、ELISA 、Bioassay)检测藻株的毒性是一致的。可见，McyB 基因单元可作为特殊的分子标志物，鉴定产毒和非产毒微囊藻藻株。KumayerR，KutzenbergerT ，等用基于 Taq 核酸酶(TNA) 的 RT 一 PCR 法检测蓝藻的两个基因区域，一个是藻蓝蛋白操纵子的基因间隔序列，用于定量蓝藻种群的总数，另一个是McyB 基因，用于定量蓝藻的产微囊藻毒素基因型。他们使用该法研究 Wannsee 湖中产毒基因型在种群中随季节的变化，发现 McyB 基因型从冬到夏，平均比例都是稳定的。但不同表型中产毒基因型的比例很不相同，铜绿微囊藻藻株中 73%含有 McyB 基因，Michthyoblabe 藻株中仅 16%含有