液相色谱-串联质谱联用法测定犬血浆中氨氯地平和阿托伐他汀的浓度

_作者简介：赵曦（1979） ，男，硕士，工程师，从事体内药物分析及药物体内代谢联系电话：（0311）87896852；E-mail：液相色谱 -串联质谱联用法测定犬血浆中氨氯地平和阿托伐他汀的浓度赵曦，岳进，张彦玲，何颖娜，杨汉煜；石药集团药物研究院，河北 石家庄 050051摘要：目的：建立了LC-MS/MS法同时测定犬血浆中氨氯地平和阿托伐他汀的含量。 方法：样品用沉淀蛋白法处理，采用C 18柱，流动相为甲醇-2 mmolL-1醋酸胺+0.5%甲酸水溶液（6832，）流动相，以地西泮为内标，电喷雾离子化，以正离子多离子反应监测（MRM ），检测离子分别为m/z409.2 m/z238.1（氨氯地平） ，m/z559.2 m/z440.5（阿托伐他汀）和m/z285.1 m/z193.1（内标，地西泮） 。结果：氨氯地平在0.120.0 gL-1、阿托伐他汀在0.250.0 gL-1浓度范围内线性关系良好，最低定量限氨氯地平为0.1gL -1、阿托伐他汀为0.2gL -1，方法回收率均大于94% ，日内、日间RSD均小于8.8%。结论：此法专属、灵敏、准确，适用于头孢克洛临床药物动力学的研究。关键词 ：氨氯地平；阿托伐他汀；液相色谱-串联质谱法；血药浓度 中图分类号： 文献标识码 ：A 文章编号：Determination of Amlodipine and Atorvastatin in Beagle dogs Plasma by LC-MS/MSYUE Jin，ZHAO Xi， ZHANG Yan-ling ，HE Ying-na ，YANG Han-yu*(Pharmaceutical Research Institute of Shijiazhuang Pharmaceutical Group Co.,Ltd.， Shijiazhuang 050051)Abstract: OBJECTIVE：A LC-MS/MS method was established for the determination of amlodipine and atorvastatin in Beagle dogs plasma. METHORDS： The samples were precipitated with methanol. A C18 column was used with the mobile phase of methanol-2mmolL-1+0.5%formic acid (6832,).Diazepam was used as internal standard. ESI was applied and operated in positive ion mode. The detected ions were m/z409.2 m/z238.1(amlodipine), m/z559.2 m/z440.5(atorvastatin) and m/z285.1m/z193.1(diazepam). RESULTS：The calibration curve was linear in the range of 0.120.0 gL-1 (amlodipine) and 0.2 50.0 gL-1 (atorvastatin),respectively.The low limit of quantification was 0.1gL-1 (amlodipine) and 0.2 gL-1 (atorvastatin),respectively.The average recovery was more than 94%. The RSDs of intra- and inter-day were all less than8.8 %. Conclusion：The method was proved to be specific, sensitive and accurate, and suitable for clinical pharmacokinetics studies of cefaclor.KEY WORDS：amlodipine ； atorvastatin；LC/MS/MS ；plasma concentrationCADUET是由抗高血压药氨氯地平（ Amlodipine，AM）和降脂药阿托伐他汀（Atorvastatin，AT）混合而制成的复方制剂。该药物适用于同时患有高血压和高脂血症的患者，其可以有效的控制血压和血脂水平，提高服药的顺应性，有效治疗和预防心血管系统疾病的发生，同时降低患心脏病的风险。由于该复方产品具有良好的疗效，因此对其进行了大量的研究，为满足临床前及临床药代动力学研究的需要，要求建立一种有效的分析方法。目前已有文献报道采用HPLC法、LC-MS法分别测定AM 或AT的浓度 16。本研究建立了LC-MS/MS法同时测定血浆样品中AM和AT两种组分的含量，该方法专属性强、灵敏度高、重现性好，血浆样品前处理方法快速、简便，可用于复方AM和AT制剂的临床前药代动力学和毒代动力学研究。1 仪器与试药API 4000型液相色谱 三重四级杆质谱联用仪，配有电喷雾离子化ESI源，Analyst 1.4 软件（美国ABI公司） ；Agilent 1100色谱系统（含四元梯度泵，在线脱气机，自动进样器，柱温箱；美国安捷伦公司） 。马来酸左旋氨氯地平对照品（河北省药品检验所，含量为99.2%，批号0269-9701 ） ；阿托伐他汀钙对照品（中国药品生物制品检定所，含量为99.2%，批号100590-200501 ） ；地西泮（内标，IS）对照品（中国药品生物制品检定所，含量：99.1%，批号1225-9601） ；马来酸左旋氨氯地平（石家庄欧意药业有限公司提供，含量：99.8%，生产批号：109060901） ；阿托伐他汀钙（石家庄欧意药业有限公司提供，含量：99.1%，生产批号：20061001） ；甲醇、甲酸和醋酸胺均为色谱纯；实验用水为娃哈哈纯净水。2 方法与结果2.1 液相色谱条件 色谱柱：美国Waters公司 Atlantis dC C18柱（100 2.1mm，3 m ） ；流动相：甲醇2 mmolL-1醋酸胺+0.5%甲酸水溶液（ 6832） ；流速0.3mL min-1；进样量20L；柱温20。2.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子化（ESI）源；喷雾电压 IS 4500V；雾化温度 500 ；雾化气40Lmin-1；帘气 25L/min；碰撞气 6Lmin-1；辅助气 30Lmin-1；。检测方式为正离子多离子反应监测（MRM） ，检测离子反应分别为 m/z409.2 m/z238.1（AM ） ，m/z559.2 m/z440.5（AT ） ，m/z 285.1 m/z193.1（IS） 。质谱图见图 1，碰撞诱导解离电压分别为15V（AM） ，35V （AT ）和 30V（内标，IS） ；驻留时间（dwell time）均为 200ms。2.3 溶液配制AM 标准溶液：精密称取马来酸左旋氨氯地平对照品 32.4mg（相当于 AM 25.0mg） ，置 25 mL 量瓶中，以甲醇溶解并定容，得 1.0 gL-1 的 1 贮备液；依次用甲醇稀释成1.0，2.0，5.0，15.0，50.0，200.0 gL -1 的 AM 标准系列溶液。AT 标准溶液：精密称取阿托伐他汀钙对照品 26.0mg（相当于 AM 25.0mg） ，置 25 mL 量瓶中，以甲醇溶解并定容，得 1.0 gL-1 的 AT 贮备液；依次用甲醇稀释成2.0，5.0，15.0，50.0，150.0，500.0 gL -1 的 AT 标准系列溶液。内标溶液：精密称取 IS 对照品 25.3mg，置于 25mL 量瓶中，以甲醇溶解并定容，得1.0 gL-1 的 IS 贮备液；再用甲醇稀释成 100 gL-1 的内标工作溶液。2.4 血浆样品处理 精密吸取血浆样品 0.1mL，置 2mL 离心管中，加入内标工作溶液 0.2mL，精密加入甲醇溶液 0.2mL，旋涡混合 0.5min，离心（10000r min-1）5min；精密吸取上清液 0.1mL，置 2mL 离心管中，加入流动相 0.2mL，旋涡混合 0.5min，取 20L 进行 LC-MS/MS 分析。2.5 专属性试验 空白血浆，空白血浆加入AM（0.1 gL-1）、AT（0.2 gL-1）和IS（100 gL-1）和健康受试动物给药3h后血浆样品的色谱图见图2。结果表明，空白血浆中内源性物质不干扰待测物和内标的测定。AM、AT和IS 的保留时间分别为1.55min、4.35min 和3.57min 。2.6 标准曲线和定量限取空白犬血浆0.8ml，分别加入AM和AT标准系列溶液各0.1mL，得到分别相当于AM血浆浓度为0.1，0.2，0.5，1.5，5.0，20.0 gL -1和AT 血浆浓度为0.2，0.5，1.5，5.0，15.0，50.0 gL -1的标准系列血浆工作液，精密吸取上述标准系列血浆工作液0.1mL，其余按 “2.4”项下操作，分别以AM和AT浓度c为横坐标，分别以1、2与内标3的峰面积比R为纵坐标，用加权最小二乘法（1/c 2）进行回归 7，得回归方程分别为：R =0.0745c+0.00301，（r=0.9990， 1） ，R =0.0253c+0.00518，（r=0.9995，2） 。表明，AM浓度在0.120.0 gL -1、AT浓度在0.250.0 gL -1范围内，线性关系良好。 AM、AT的最低定量限分别为0.1 gL -1、0.2 g L-1。ABCA：AM 的 ESI 一级质谱图（I）和二级质谱图（II） ；B：AT 的 ESI 一级质谱图（I）和二级质谱图（II） ；C ：IS 的 ESI 一级质谱图（I）和二级质谱图（II ）图 1 AM、AT 和 IS 的质谱图30 320 340 360 380 40 420 40 460 480 50 m/z,au5.e6 1.0e7 1.5e7 2.0e7 2.5e7 3.0e7 3.5e7 4.0e7 . 409.2 46.2 41.2 348.2 +MS2 (409.3) CE (2): 0.134 to0.21 min fro Sample 1(TuneSam. Max. 41e6 cps. 10 150 20 250 30 350 40 450 50 m/z,au5.e 1.0e6 1.5e6 2.0e6 2.5e6 3.0e6 3.5e6 4.0e6 38.1 294. 409.3 37.1 392. 2. +Q1: 2.05 to2.06 min fro Sample 1(TuneSampleID) ofMT20561408293.wif (Turbo Spray Max. 25e7 cps.160 180 20 20 240 260 280 30 320 340 360 380 40 m/z, au2.0e 4.6 .0e 8.6 1.0e7 .2 1.4e7 .6 1.8e7 2.0 .e7 2.4 8. 287.0 1.2 17.0 237.1 3.4 +MS2 (85.10) CE (40): .267 to0.31 min fro Sample 1(TuneSampleID) ofT0643. Max. 3e6 cps.60 8 10 2 140 6 180 2 20 4 260 8 30 20 34 60 38 40 m/z,au6.0e5 8.1.0e6 .21.4e6 .1.8e6 2.0.e6 2.4.6e 2.83.0e6 .2 193.54. 2. 28. 257. 285. 9. 精密度与回收率 8按“2.6”项下方法制备含有AM和AT的低、中、高3个浓度（AM为0.2，1.5，15.0 gL-1；2为0.5，5.0，40.0 gL-1）的血浆质控样品，每个浓度6份，连续测定3批，进行方法学确证，以同批的标准曲线计算样品AM、AT的浓度。计算得 AM的日内RSD（%，n=6）分别为4.3、2.7、1.7，日间RSD（% ，n=6）分别为7.0、5.6、5.7；AT的日内RSD（ %，n =6）分别为1.8、3.8、4.3，日间RSD（% ，n=6）分别为3.4、8.7、5.5。方法回收率，AM的分别为100.5% 、100.3 %、101.7% ；AT的分别为97.4%、96.5 %、94.6%。内标溶液经同法处理，其回收率为99.7%。ABCA：空白血浆；B：空白血浆 +AM（0.1gL -1）+AT（0.2 gL-1）+IS（100 gL -1） ；C：受试者服药 3h 后血样 - AM；-AT；- IS图2 血浆中AM、AT及内标IS 的MRM 色谱图2.8 稳定性考察 分别考察AM（浓度分别为0.2和15.0 gL-1）和AT（浓度分别为0.5和40.0 gL-1）血浆样品中室温放置4 h、预处理后室温放置24 h、冻融3 次和-20冻存30d的稳定性，所得AM浓度的RSD（%，n=3）分别为5.1和2.3、5.3和3.0、3.1和1.4、2.9和3.5；所得AT浓度的RSD（%，n=3）分别为3.5和1.9、4.5和2.5、1.8和1.7、2.4 和1.6。表明在上述条件下AM和AT均稳定。2.9 药动学研究6只Beagle犬单剂量口服复方马来酸左旋氨氯地平 /阿托伐他汀钙胶囊（剂量配比为：AM:AT=0.125mg/Kg:1.0mg/Kg），其给药后的血药浓度- 时间曲线见图3。0.05.010.015.00 12 24 36 48 t/hC/ng.ml-1 AMAT图 3 Beagle 犬单剂量给药后 AM 和 AT 的平均药-时曲线（n=6）3 讨论3.1 据文献报道，国内采用LC-MS/MS 1,4、HPLC 法 2,5测定血浆中的1或2浓度，HPLC法不仅灵敏度低，而且分析周期较长。LC-MS/MS方法，仅见分别单独测定血浆中的 1或2，若按文献方法测定给予复方马来酸左旋氨氯地平/阿托伐他汀钙胶囊后的犬血浆样品，前处理方法不同，无法同时测定两种组分，只能分别测定，从而造成血浆用量大大增加。本研究所建立的LC-MS/MS方法，认真摸索了血浆样品前处理方法和色谱、质谱分析条件，将两种在理化性质和色谱行为方面存在较大差异的物质同时进行测定，而且克服了基质效应、残留污染等的影响。采用本文所建立的LC-MS/MS方法对血浆样品进行分析，样品用量少（仅用0.1ml血浆样品），血浆中内源性物质对测定无干扰，方法的灵敏度和选择性高（AM最低定量浓度为0.1 ng/ml，AT最低定量浓度为0.2 ng/ml），而且大大缩短了分析周期，每个样品所需分析时间仅为5.5分钟。该方法回收率较高且稳定，灵敏度、精密度和准确度均较高，专属性强，本方法灵敏、快速、简便，已成功用于临床前药代动力学和毒代动力学的研究。3.2 本研究曾考察过液-液提取和固相萃取等多种血浆样品处理方法，但由于理化性质的差异无法采用同一种提取条件将AM和AT同时提取；而固相萃取时所采用的高有机比例的洗脱液，容易使1和2出现严重的溶剂效应，影响AM和AT的测定。因此，经考察最终采用沉淀蛋白法对血浆样品进行处理。参考文献：1 ZHANG Y，CHEN X Y，ZHONG D F et alAssessment of pharmacokinetics and bioequivalence amlodipine besylate in healthy volunteersJ J Fourth Mil Med Univ（第四军医大学学报），2006，27（2）：1722 YUAN G P，CHEN S Z，JIN N B et alReversed Pharse HPLC Determination of Amlodipine in Human PlasmaJStrait Pharmaceutical Journal（海峡药学），2004，16（4）：513 Tatar S，Atmaca S Determination of amlodipine in human plasma by high-performance liquid chromatography fluorescence detection JJ chromatogy B Biomed Sci Appl，2001，758：3054 DI X H，YANG Y G，MEI W et alStudies on bioequivalence of atorvasta