guan-3动物细胞培养1

第 3 章n动物细胞与组织培养动物的细胞与组织培养定义： 从动物体内取出组织或细胞，模拟机体内生理环境，在体外建立无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能的方法。1 动物细胞培养n 群体培养（ mass culture） ：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（ confluence）后形成均匀的单细胞层n 克隆培养（ clonal culture） ：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。群体培养（左）和克隆培养（右） Definitions of Tissue Culture Termsn cell culture - the maintenance and growing of dispersed cells outside the organism.n Secondary culture Cells taken from a primary culture and passed or divided in vitro. These cells have a limited number of divisions or passages.n tissue culture - the maintenance of a tissue or fragment in a way that may allow differentiation and preservation of the architecture and/or function n monolayer - single layer of cells growing on a surfacen organ culture - maintenance of tissues, whole or parts of organs in a way that may allow differentiation and preservation of the architecture and/or functionn explant - an excised fragment of an organ which usually retains some degree of tissue architecturen 原代培养 （ primary culture） ：即细胞或组织离开机体后的首次培养。n primary culture - started from cells, tissues or organs taken directly from an animaln 传代（ passage） ： 培养的细胞生长到一定的密度后转移到新的容器中培养或需要更换到新的培养液称为传代或传代培养。n subculture - the transplantation of cells from one culture to another (passaging)n 细胞系（ cell line） ： 原代培养物经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代或传代数有限，可称为有限细胞系。如果可以连续传代则称为连续细胞株原代培养细胞成功传代即为细胞系。n cell line - arises from the primary culture at the time of the first subculture - “finite“ life spann continuous cell line - a cell line which has been “transformed“ - “infinite“ life spann 细胞株（ cell strain） ：从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。 n 克隆（ clone） ： 亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。2 发展历史n 动物细胞（组织）培养技术起源于 19世纪所应用的某些胚胎学技术。n 动物细胞（组织）培养的奠基人是美国生物学家 Harrison。在 1907年采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程。n Harrison - - isolated pieces of frog embryonic tissue known to give rise to nerve fibres - grew them in frog lymph - observed outgrowth of axons over period of weeks in 1907. n 法国学者 Carrel功不可没。他 1923年设计的卡氏培养瓶，用鸡胚抽提液培养心肌组织取得成功并维持 34年之久 ,特别注意到实验中的无菌操作。表三、实验室中常用的几种细胞系细 胞系名称 细 胞 类 型 来源3T3 成 纤维细 胞 小鼠HeLa 宫颈 癌上皮 细 胞 Henrietta Lacks BHK21 成 纤维细 胞 叙利 亚仓 鼠PtKl 上皮 细 胞 袋鼠L6 成肌 细 胞 大鼠PCI2 嗜 铬细 胞 大鼠SP2 浆细 胞 小鼠SP2 0 骨髓瘤 浆细 胞 小鼠CHO 卵巢 细 胞 中国地鼠Henrietta Lacks, American black ,died of cancer of uterine cervix in 1951 3 应用领域n 生产单克隆抗体和疫苗。n 组织与器官再生、培养。n 动物细胞基因工程动物细胞培养生产的生物制品 n （ 1） 病毒疫苗： 乙肝疫苗 (HbsAg)、脊髓灰 质炎疫苗 (Polio)、 狂犬疫苗 (Rabies)等。n （ 2） 非抗体免疫调节剂： 干扰素 （ IFN ）、 白细胞介素（ IL ） 、 B 细胞生长因子 （ BCGF ）、 巨噬细胞激活因子（ MAN） T 细胞替代因子（ TRF）等。n （ 3） 多肽生长因子： 神经生长因子（ NGF ）、成纤维细胞生长因子 （ FGF）、 表皮生长因子（ EGF）、 血清生长因子 （ SF） 等。n （ 4） 酶类： 组织血纤维溶酶原激活剂（ t PA ） 等。n （ 5） 激素： 红细胞生成素（ EPO） 、促黄体生成素（ LH）、 促滤胞素（ FSH） 等。n （ 6） 肿瘤特异性抗原： 癌胚抗原（ CEA）等。n （ 7） 单克隆抗体 （ MCAB ）。n （ 8） 病毒杀虫剂： 杆状病毒等。n （ 9） 皮肤移植： 单细胞培养等。 n 3.1.1 动物细胞的特点n 问题一n 与微生物、植物细胞相比，动物细胞有哪些特殊之处？动物细胞与微生物细胞相比，主要有以下不同：n （ 1）动物细胞比微生物细胞 大 ， 无细胞壁 。n （ 2）动物细胞倍增时间长， 生长缓慢 ， 易受污染 。n （ 3）培养过程 需氧量少 ，对机械搅拌或 剪切力敏感 。n （ 4）动物细胞间主要以 聚集体形式 存在。n （ 5）原代细胞一般繁殖 50代 左右即退化死亡。3.1.2 体外培养原代培养 （亦称初代培养）传代培养 （亦称继代培养）。Primary Cultureretention of the 3D shapeoutgrowth and migration of cells3.1.3 动物细胞（组织）培养的生长特性 n 体外培养细胞类型1 粘附型细胞 anchorage dependent n 粘附生长 是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。粘附有两种含义：一是细胞之间相互接触；二是细胞与细胞外基质结合。 n 动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞是必须附壁即附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长，这时若取走一片细胞，存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重新布满创面 , 称为单层附壁培养 。 细胞贴壁延展过程Contact inhibitionWhen cells contact each other, they cease their growth. Cells arrest in G0 phase of the cell cycle.Transformed cells will continue to proliferate and pile up each other.体外培养细胞类型（形态）n 1 成纤维型n 2 上皮型n 3 游走型n 4 多形型（一）成纤维细胞型细胞 Fibroblastn 外形与体内 成纤维 细胞形状相似，细胞大致呈 梭形或不规则形 。前者贴壁后呈长梭形，圆形细胞核位于中央，胞质外伸出 2 3个长短不同的突起，生长时呈放射状、漩涡状走向。n 多数细胞之间 排列疏散 ，有较大的细胞间隙。有时也相互平行排列，成群细胞呈现 放射状、旋涡状 等形式。心肌，平滑肌、血管内皮细胞的体外培养常呈此类型。（二）上皮型细胞 Epithelial celln 类似上皮细胞的细胞，特点是： 扁平 状，形态较为规则 ，细胞贴壁后呈 三角形 及不规则扁平的 多角形，中央有扁圆形核，生长时彼此 紧密 连接成单层细胞。因为相互拥挤而呈现“ 铺路石状 ” 。n 皮肤的表皮细胞、消化道与呼吸道的上皮细胞、肺泡上皮细胞、消化腺上皮细胞、血管内皮细胞等， Hela（ 三）游走型细胞 wanderingn 分散生长，一般不连接成片形成群落；细胞胞质常伸出伪足和突起；在培养器皿壁上生长位置不固定，呈活跃的游走和变形运动，速度快且方向不规则。n 该类细胞不稳定， 外形不规则且不断变化 ，当细胞密度增大、连接成片时，形状类似于成纤维样细胞型或上皮细胞型。n 表现这种细胞形态的主要是单核巨噬细胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、某些肿瘤细胞等。 （ 四）多形型细胞 Polymorphicn 多形型细胞是一些形态上 不规则 的细胞。n 多形型细胞不常见，只有某些像神经组织细胞等难以确定其稳定形态 的，才可归于多形细胞。体外培养呈现多形型细胞的细胞最常见的是 神经元和神经胶质细胞 。 影响细胞形态的因素n 能够影响细胞形态学特征的主要因素包括： 血清成分、培养基成分及添加成分、培养基的酸碱度、气相环境、温度 等。例如，一些已分化的细胞在有无血清的培养液中生长，形态特征就会有所差异。n 形态会因条件而改变（来源、生长条件和功能状态不同）。2 非粘附型细胞（悬浮型细胞）n 体外生长不贴壁，可在培养液中悬浮生长，因此也叫 悬浮 型细胞。