人教版教学课件内蒙古海拉尔三中高中生物选修一《多聚酶链式反应扩增dna片段》课件

多聚酶链式反应多聚酶链式反应扩增扩增 DNA片断片断一个核苷酸上的一个核苷酸上的 磷酸基团上的磷酸基团上的 “ OH”和和 另一个另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基 之间失去之间失去一分子水，形成一分子水，形成 磷酸二脂键，磷酸二脂键， 即在即在 相邻的相邻的 两个两个脱氧核苷酸的脱氧核苷酸的 3和和 5碳原子碳原子 之间形成磷酸二脂键之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过 3、 5、磷酸、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。 通常通常将将 DNA的的 羟基羟基 “ OH”末端称为末端称为 3端，而磷酸基端，而磷酸基团的末端称为团的末端称为 5端端4、多脱氧核苷酸链得形成、多脱氧核苷酸链得形成脱氧核苷酸结构式脱氧核苷酸结构式OOPOHO碱基OOHOOPOHOOH碱基5335 碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖磷酸基团磷酸基团碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖53多脱氧核苷酸链结构简图多脱氧核苷酸链结构简图 RNA 引物的合成引物的合成以单股以单股 DNA为模板，在引物酶的作用下合成为模板，在引物酶的作用下合成小段的小段的 RNA引物引物 DNA 的生成的生成以单股的以单股的 DNA为模板，在为模板，在 DNA聚合酶的作用下合聚合酶的作用下合成成 DNA。边解旋边复制边解旋边复制 (过程）过程）复制特点复制特点半保留复制（结果）半保留复制（结果）遵循原则遵循原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则（四）（四） PCR(多聚酶链式反应）多聚酶链式反应）1、 DNA聚合酶聚合酶 特性特性不能从头合成不能从头合成 DNA，只能从，只能从 DNA的的 3 端开始端开始延伸延伸 DNA链，因此，链，因此， DNA复制需要引物复制需要引物2、 DNA聚合酶聚合酶 作用过程作用过程当引物与当引物与 DNA母链通过碱基互补配对结合后母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的聚合酶就能从引物的 3 端开始延伸端开始延伸DNA链，链， DNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的 5端向端向 3 端延伸端延伸3、 PCR原理原理 在在 80 100C 的温度范围内，的温度范围内， DNA的双螺的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性 当温度缓慢降低后，两条彼此分离的当温度缓慢降低后，两条彼此分离的 DNA链链又会重新结合成双链又会重新结合成双链 PCR 利用了利用了 DNA的热变性原理，通过控制温的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的度来控制双链的解聚与结合，现在使用的 PCR仪仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器实质上也是一台能够自动调控温度的仪器高温解决了打开双链的问题，但是，又导致高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的聚合酶失活的问题，耐高温的 Taq DNA聚合酶解决了高温导致聚合酶解决了高温导致 DNA聚合酶失活的问聚合酶失活的问题，促成了题，促成了 PCR技术的自动化技术的自动化4、 Taq DNA聚合酶的应用聚合酶的应用5、 缓冲液需要为缓冲液需要为 PCR反应提供的物质反应提供的物质DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的物，四种脱氧核苷酸，耐热的 DNA聚合酶，同聚合酶，同时通过控制温度使时通过控制温度使 DNA复制在体外反复进行复制在体外反复进行PCR技术是技术是 80年代中期发展起来的体外核酸年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、它具有特异、敏感、产率高、 快快速、速、 简便、重复性好、易自动化等突出简便、重复性好、易自动化等突出 6、 PCR技术的特点技术的特点7、 细胞内和细胞外细胞内和细胞外 DNA复制环境的区别复制环境的区别体内体内 DNA的复制的复制 体外的模拟体外的模拟模板（母链模板（母链）细胞内源细胞内源 外源加入外源加入引物引物 引物合成酶引物合成酶 外源加入外源加入底物底物 dNTP 细胞内源细胞内源 外源加入外源加入聚合酶聚合酶 细胞内源细胞内源 外源加入外源加入反应环境反应环境 细胞内环境细胞内环境 缓冲液缓冲液 PCR 过程需要的引物不是过程需要的引物不是 RNA，而是人工，而是人工合成的合成的 DNA单链，其长度通常为单链，其长度通常为 20 30个脱个脱氧核苷酸氧核苷酸8、细胞内复制和、细胞内复制和 PCR不同点不同点 PCR 过程中过程中 DNA的解旋不依靠解旋酶，而是的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的通过对反应温度的控制来实现的（五）（五） PCR的反应过程的反应过程1、 PCR的反应步骤的反应步骤PCR一般经历三十多次循环，一般经历三十多次循环， 每次循环可以每次循环可以分为三个基本步骤分为三个基本步骤 变性、复性和延伸变性、复性和延伸 变性（模板变性（模板 DNA解旋）解旋）模板模板 DNA经加热至经加热至 900C以上。一定时间后，使以上。一定时间后，使模板模板 DNA双链或经双链或经 PCR扩增形成的双链扩增形成的双链 DNA解解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备轮反应作准备2、循环过程、循环过程靶序列靶序列靶序列靶序列PCR 循环第一步循环第一步 ：加热变性：加热变性 复性（退火）复性（退火）模板模板 DNA经加热变性成单链后，温度降到经加热变性成单链后，温度降到 500C左右，引物与模板左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合单链的互补序列配对结合靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物 引物引物 53553533PCR 循环第二步循环第二步 ：引物与靶序列退火：引物与靶序列退火 延伸延伸DNA模板引物结合物在模板引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的成一条新的 DNA链链靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物 引物引物 53553533Taq DNA聚合酶聚合酶PCR 循环第三步循环第三步 ：引物延伸：引物延伸靶序列靶序列靶序列靶序列第第 1个个 PCR 循环完成后循环完成后 ：得到两个拷贝的：得到两个拷贝的靶序列靶序列循环循环次数次数DNA数量数量1 22 43 820 1,048,57630 1,073,741,8243、 30次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量4、 PCR 循环的结果循环的结果 DNA 聚合酶只能特异性地复制处于两个引聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的物之间的 DNA序列，使这段固定长度的序列呈序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增指数扩增 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物为模板参与反应，并且由引物 延伸而成的延伸而成的DNA单链会与引物单链会与引物 结合，进行结合，进行 DNA的延伸的延伸二、二、 PCR 的实验操作的实验操作1、 PCR仪仪（一）设备及用具（一）设备及用具实质上一台能够实质上一台能够 自动调控温度自动调控温度 的仪器的仪器2、微量离心管、微量离心管一种一种 薄壁塑料管薄壁塑料管 ，总容积为，总容积为 0.5ml3、微量移液器、微量移液器用于用于 定量转移定量转移 PCR配方中的配方中的 液体，液体， 其上其上的一次性吸液枪头用一次更换一次的一次性吸液枪头用一次更换一次PCR仪仪微量离心管微量离心管微量移液器微量移液器1、准备、准备2、移液、移液（二）实验操作步骤（二）实验操作步骤按照按照 PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上放在实验桌上用微量移液器按照用微量移液器按照 PCR反应体系配方往微反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂量离心管里面加入各种试剂 过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁轻轻弹击管壁 注意注意：3、混合、混合B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀是使反应液混合均匀A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢脱落或液体外溢将离心管放入将离心管放入 PCR仪上，设置好仪上，设置好 PCR仪的循仪的循环程序环程序 过程：将微量离心管放在离心机上过程：将微量离心管放在离心机上 ,离心约离心约10s4、离心、离心5、反应、反应 离心目的：使反应液体集中在离心管底部，离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果提高反应效果循环数循环数 变性变性 复性复性 延伸延伸第一次第一次 94C ，10min 30次次 4 ，30s55 ， 30s 72 ，1min最后一次最后一次 4 ，1min55 ， 30s 72 ，1minPCR技术技术 高度灵敏