人教版教学课件选修一22土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课件

课题课题 2土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离与计数分离与计数专题专题 2微生物的培养与应用微生物的培养与应用一、课题背景一、课题背景1、尿素的利用、尿素的利用尿素尿素 是一种重要的是一种重要的 农业氮肥。农业氮肥。 尿素尿素 不能直接不能直接 被农被农作物作物 吸收。吸收。 土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素 分解成氨分解成氨 之后才之后才能被植物利用。能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们 能合成脲酶能合成脲酶CO(NH2)脲酶脲酶+ H2O + CO2NH33、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。也能分解尿素。4、课题目的、课题目的 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一一 .研究思路研究思路 .筛选菌株筛选菌株 .统计菌落数目统计菌落数目 .设置对照设置对照1、实例：、实例：启示：启示： 寻找目的菌种时要根据它对生存环境的寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。原因：原因： 因为热泉温度因为热泉温度 70 800C， 淘汰了绝大淘汰了绝大多数微生物只有多数微生物只有 Taq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应 是是一种在体外将一种在体外将 少量少量 DNA大量复制大量复制 的技术，此项的技术，此项技术要求使用技术要求使用 耐高温（耐高温（930C）的）的 DNA聚合酶。聚合酶。要要 分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条包括营养、生理、生长条 件等；件等；方法：方法： 抑制大抑制大 多数微生物不能多数微生物不能 生长生长 造造 成有利于该菌生长的环成有利于该菌生长的环 境，境，结果：结果： 培养一培养一 定时定时 间后，该菌数间后，该菌数 量上升，再通过量上升，再通过平板稀释等方法对它进行平板稀释等方法对它进行 纯化培纯化培 养分离。养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于人为提供有利于 目的菌株目的菌株 生长的条件生长的条件 (包括营包括营养、温度、养、温度、 pH等等 )，同时抑制或阻止其他微生，同时抑制或阻止其他微生物生长。物生长。15.0g琼脂琼脂1.0g尿素尿素10.0g葡萄糖葡萄糖0.2gMgSO47H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：养基： 从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基 在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源： 葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源： 尿素尿素培养基的培养基的 氮源为尿素氮源为尿素 ，只有能合成，只有能合成 脲酶脲酶 的微生物的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。才能分解尿素，以尿素作为氮源。 缺乏缺乏 脲酶的微脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。择出分解尿素的微生物。5、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用 血球计数板血球计数板 ，在显微镜下计算一定容积里，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。 .统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点2.间接计数法（间接计数法（ 活活 菌计菌计 数法）数法） 原理：原理： 在稀释度足够高时，微生物在固体培在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细而成的，即一个菌落代表原先的一个单细 胞。胞。 常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数 (CV)M其中，其中， C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数， V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积 (ml)， M代表稀释倍数。代表稀释倍数。注意事项注意事项 为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在 30300 的平板上进行计数。的平板上进行计数。 为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将 同一稀释度加到三同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中个或三个以上的平皿中 ，经涂布，培养计算出，经涂布，培养计算出菌落平均数。菌落平均数。 统计的菌落往往比活菌的实际数目统计的菌落往往比活菌的实际数目 低。低。 涂布平板法所选涂布平板法所选 择的稀择的稀 释度很重要，一般以释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释三个稀释度中的第二个稀释 度所度所 出现的平均菌出现的平均菌落数在落数在 50个左右为最好。个左右为最好。计数法计数法直接计数法、直接计数法、平板计数法、平板计数法、比浊法、比浊法、膜过滤法膜过滤法例题：统计菌落数目的方法有例题：统计菌落数目的方法有 （ ）A. B. C. D.D 涂布平板法涂布平板法 重量法重量法 直接计数法直接计数法 比浊法比浊法 生理指标法生理指标法 膜过滤法膜过滤法设设 置对照的主要目的置对照的主要目的 是排除实验组中非测试因素是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 .设置对照：设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，目的实验时， A同学从对应的同学从对应的 106倍稀释的培养基倍稀释的培养基中筛选出大约中筛选出大约 150个菌落，但是其他同学在同样个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约的稀释度下只选择出大约 50个菌落。分析其原因个菌落。分析其原因。 原因：原因： 土样不同，土样不同， 培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误 (或或者是混入了其他的含氮物质者是混入了其他的含氮物质 )小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一： 由其他同学用与由其他同学用与 A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二： 将将 A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测： 如果结果与如果结果与 A同学一致，则证明同学一致，则证明 A无误无误；如果结果不同，则证明；如果结果不同，则证明 A同学存在操作失误或培同学存在操作失误或培养基的配制有问题。养基的配制有问题。二二 .实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 .制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的 选择培养基 。 应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤 10g。 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁 进行进行 分离不同的微生物采用不同的稀分离不同的微生物采用不同的稀 释度释度原因：不原因：不 同微生物在土壤中含量同微生物在土壤中含量 不同不同目的：保目的：保 证获得菌落数在证获得菌落数在 30 300之间、适于计之间、适于计数的数的 平板平板三三 样品的稀释样品的稀释为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原因：原因： 土壤中各类微生物的数量（单位：株土壤中各类微生物的数量（单位：株 /kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为：好氧及兼性厌氧细菌数约为 2 185万，放线菌万，放线菌数约为数约为 477万，霉菌数约为万，霉菌数约为 23.1万。万。结论：结论： 为获得不同类型的微生物，就需要按不为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。提供选择培养的条件。 .取样涂布取样涂布 实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。 如果得到了如果得到了 2个或个或 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在 30300 的平板的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果如果 同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确试验不精确 ，需要重新实验。，需要重新实验。 .微生物的培养与观察微生物的培养与观察在在 菌落计数时，每隔菌落计数时，每隔 24h统计一次菌落数统计一次菌落数 目。目。选选 取菌落数目稳定时的记录作为结果，取菌落数目稳定时的记录作为结果， 以防止以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培培 养不同微生物往往需要不同培养温养不同微生物往往需要不同培养温 度。度。细菌：细菌： 30 37 培养培养 1 2d放线菌：放线菌： 25 28 培养培养 5 7d霉菌：霉菌： 25 28 的温度下培养的温度下培养 3 4d。微生物的培养与观察微生物的培养与观察三三 .结果分析与评价结果分析与评价1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。2.提示：选择每个平板上长提示：选择每个平板上长 有有 30300 个个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合 适适。同。同 一稀释倍数的三个重复的菌落数不能一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。四、操作提示四、操作提示 无菌操作无菌操作 做好标记做好标记 规划时间规划时间 五五 .课外延伸课外延伸在在 以尿素为唯一氮源的培养基中加入以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果酚红指示剂。培养某种细菌后，如果 PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素分解尿素 。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝 培养培养基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌 菌落呈现黑色菌落呈现黑色 ，通过记述得出，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在伊大肠杆菌在伊 红美蓝琼脂红美蓝琼脂 (EMB)上典型特征上典型特征 本课题知识小结本课题知识小结 :六、例题解析 例 1对细菌群体生长规律测定的正确的表述是A在液体培养基上进行 B至少接种一种细菌 C接种一个细菌 D及时补充消耗的营养物质解析：细菌群体 生长规律的测定 是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一 种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数 。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。答案： A例 2在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是A调整期 B对数期 C稳定期 D衰亡期解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在 稳定期 的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少， pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。答案： C1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ）A.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌 C.接种一个细菌 D.及时补充消耗的营养物质 2.使用选择培养基的