总rna提取定量与rt-pcr__20111226

/sfzx/总总 RNA的提取、定量与的提取、定量与 RT-PCR南方医科大学南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学示范中心生物化学与分子生物学实验教学示范中心Expertimental Teaching Center of Biochemistry and Molecular Biology/sfzx/p 完整完整 RNA的提取和纯化的提取和纯化 ,是进行是进行 RNA 方面的研究工作如方面的研究工作如Nothern杂交、杂交、 mRNA分离、分离、 RT-PCR、定量、定量 PCR、 cDNA合成合成及体外翻译等的前提。及体外翻译等的前提。p 掌握从细胞中提取总掌握从细胞中提取总 RNA的方法的方法p 熟悉紫外吸收法检测熟悉紫外吸收法检测 RNA浓度与纯度的原理及测定方法浓度与纯度的原理及测定方法p 掌握掌握 RT-PCR基因扩增的原理和过程基因扩增的原理和过程目目 的的/sfzx/实验流程实验流程提取原理提取原理操作步骤操作步骤逆转录原理逆转录原理操作步骤操作步骤提提 取取总总 RNA 定定 量量合成合成 cDNA第一链第一链原理体系原理体系引物选择引物选择PCR电泳原理电泳原理电泳步骤电泳步骤电电 泳泳计算方法计算方法操作步骤操作步骤/sfzx/第一部分 细胞总 RNA的提取及定量Extraction and Quantitation of Cell Total RNA /sfzx/所有 RNA的提取过程中都有五个关键点：1. 样品细胞或组织的有效破碎；2. 有效地使核蛋白复合体变性；3. 对内源 RNA酶的有效抑制；4. 有效地将 RNA从 DNA和蛋白混合物中分离；5. 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去 。 关关 键键 点点/sfzx/原原 理理p 10-5g RNA/ 细胞 p RNA分离的方法 ：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法；盐酸胍 -有机溶剂法；氯化锂 -尿素法；蛋白酶 K-细胞质 RNA提取法；异硫氰酸胍 -酚 -氯仿一步法 (Trizol法 )等。p 目前常用的是 Trizol法。rRNA 80-85%： 28S 18S 5StRNA, snRNA 10-15%mRNA 1-5%/sfzx/原原 理理p Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂p 其主要成分是 异硫氰酸胍 和 酚 。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白 /核酸物质解聚得到释放。p 酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制 RNA酶活性，因此 Trizol中还加入了 8-羟基喹啉、 - 巯基乙醇等来抑制内源和外源 RNase。/sfzx/p 在加入 氯仿 离心后，氯仿比重大，使溶液分为水相、中间层和有机相。 RNA在上层水相中， DNA和蛋白质位于中间层，有颜色的下层为有机相。p 取出水相用 异丙醇沉淀 可回收 RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA。原原 理理/sfzx/RNA酶污染来源酶污染来源p RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。p 严格控制外源性 RNA酶的污染： 外源性的 RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。 p 最大限度地抑制内源性的 RNA酶 ：而各种组织和细胞中则含有大量内源性的 RNA酶。/sfzx/常用的常用的 RNA酶抑制剂酶抑制剂1. 焦碳酸二乙酯 （ DEPC) 是一种强烈但不彻底的 RNA酶抑制剂。它通过和 RNA酶的活性基团组氨酸的 咪唑环 结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 2. 异硫氰酸胍 目前被认为是最有效的 RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使 RNA酶失活。它既 可破坏细胞结构使核酸从核蛋白体中解离出来，又对 RNA酶有强烈的变性作用。 3. RNA酶的 蛋白抑制剂 (RNasin) 从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。 RNasin是 RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种 RNA酶结合，使其失活。 4. 其他 SDS、尿素、硅藻土等对 RNA酶也有一定抑制作用。 /sfzx/防止防止 RNA酶污染的措施酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于 180 的高温下干烤 6h或更长时间 。 2. 塑料器皿可用 0.1%DEPC水浸泡 12h以上 ，高压灭菌。3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在 3% H2O2室温 10min，然后用 0.1%DEPC水冲洗，晾干。 4. 配制的溶液应尽可能用 0.1% DEPC在 37 处理 12h以上 。然后用高压灭菌除去残留的 DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用 DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。 5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套， 实验过程中手套要勤换。 6. 设置 RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。 /sfzx//sfzx/操作步骤操作步骤 样品处理p 提取组织 RNA时，每 50 100mg组织用 1ml Trizol试剂对组织进行裂解；p 悬浮细胞先离心沉淀，每 5-10 10 6个细胞加 1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。 p 培养贴壁细胞不须消化，可直接用 Trizol进行消化、裂解， Trizol体积按 10cm2/ml比例加入。(注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量 RNA的前提；细胞数量与Trizol的比例，细胞的数量不能过多。 )实验材料 ：人胚胎肾细胞 293 /sfzx/操作步骤操作步骤1. 细胞或组织加 Trizol（ RNAisoPlus）后剧烈振荡 15s，室温放置 5min，使其充分裂解。（注意：此时可放入 -70 长期保持）2. 按 0.2ml 氯仿 /1ml Trizol加入氯仿 (本实验 加 100 l)，剧烈振荡混匀后室温放置 5min。 (注意：此步振荡非常重要，建议在旋涡振荡器上进行。 )3. 4 12,000g 离心 15min。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。 RNA主要在水相中，水相体积约为所用 Trizol试剂的60。4. 吸取上层水相，至另一离心管中。一般 400-450l 就足够了，宁少勿多！ （注：千万不要吸取中间界面） /sfzx/操作步骤操作步骤5. 加入等体积异丙醇混匀， 4 放置 5-10min。 6. 4 12,000g 离心 10min，弃上清， 离心后在管侧和管底出现胶状沉淀 。7. 按 1ml 75%乙醇 /ml Trizol加入 75%乙醇洗涤 RNA沉淀 ， （切勿触及沉淀！） 温和振荡离心管，悬浮沉淀。 8. 4 12,000g 离心 5min，尽量弃上清。 9. 室温晾干或真空干燥 RNA沉淀 5-10min。（ 注： RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。）10. 加入 10l无 RNase的水， 充分震荡混匀 。/sfzx/操作步骤操作步骤 收集适量细胞，加 500l Trizol用移液枪反复吹吸，直至裂解液中无明显沉淀向裂解液中加 100 l氯仿4 , 12000g 离心 15min吸取上 清液 200250 l 至另一 新 离心管中(切忌吸出白色中间层 )向上清中 加入 等体积异丙醇混匀4 , 12000g 离心 10min 缓慢沿离心管壁加入 500l 75%乙醇4 , 12000g 离心 5min小心尽量弃去乙醇加入 10l RNase-free水溶解沉淀备用室温静置 5min盖紧离心管盖，用手振荡 15s室温静置 5min上下颠倒离心管充分混匀室温静置 10min小心弃去上清室温干燥沉淀 2-5min（ 1） （ 2）（ 3） （ 4）（ 5） （ 6）（ 7） （ 8）（ 9）洗涤离心管壁轻轻上下颠倒/sfzx/原 理：1. 物质在光的照射下会产生对光的吸收效应 2. 而且物质对光的吸收是具有选择性的3. 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系 .紫外光吸收法紫外光吸收法/sfzx/紫外吸收检测紫外吸收检测 RNA的浓度的浓度p RNA在 260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用 260nm波长分光测定RNA浓度， OD值为 1相当于大约 40g/ml 的单链 RNA。用双蒸水稀释RNA样品（ 1lRNA+49l 水 ）倍并以双蒸水为空白对照，根据此时读出的 OD260 值即可计算出样品稀释前的浓度 : RNA (mg/ml) = 40OD 260 读数读数 稀释倍数稀释倍数 (n)/1000dsDNA(双链 DNA) 1OD260 = 50ug/mlssDNA(单链 DNA) 1OD260 = 33ug/mlRNA 1OD260 = 40ug/ml/sfzx/p RNA纯品 :OD260 /OD280 2.0(1.8 2.0)， OD260 /OD230 2.0 p 若 OD260/OD280小于 1.8，说明样品中还可能含有蛋白质或酚，应再用酚 /氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化 RNA。p 若 OD260/OD280大于 2.0，则提示 可能有异硫氰酸残存 或 RNA降解。p OD260/OD230比值小于 2.0时表明有小分子及盐存在。紫外吸收检测紫外吸收检测 RNA的纯度的纯度/sfzx//sfzx/RNA完整性检测完整性检测p 完整的完整的 RNA的甲醛电泳可明显地观察的甲醛电泳可明显地观察到到 28S和和 18S两条带，并且两条带，并且 28S大约是大约是18S的两倍宽。的两倍宽。p 若两条带不明显若两条带不明显 , 则说明则说明 RNA部分降部分降解解 ,可能的原因是污染了可能的原因是污染了 RNase。 /sfzx/常见问题分析常见问题分析p RNA得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底。B.RNA沉淀未完全溶解。p A260/A2801.65 ：A.RNA应使用 TE Buffer稀释后再进行吸光度值的测定。低离子浓度和低 pH值条件下 A280值偏高。B.样品匀浆时加的试剂量太少。C.匀浆样品时未在室温放置 5分钟。D.吸取水相时混入了有机相。E.RNA沉淀未完全溶解。/sfzx/p RNA降解A.组织取出后没有马上处理或冷冻。B.待提取 RNA的样品没有保存于 -60至 -70 ，而保存在了 -5至 -20 。C.细胞在用胰酶处理时过度。D.溶液或离心管未经 RNase去除处理。E.电泳时使用的甲醛 pH值低于了 3.5 。p DNA污染A.样品匀浆时加的试剂量太少B.样品中含有有机溶剂 (如乙醇， DMSO等 )，强缓冲液或碱性溶液常见问题分析常见问题分析/sfzx/第二部分 逆转录 -聚合酶链反应Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction /sfzx/p 提取组织或细胞中的总提取组织或细胞中的总 RNA， 以其中的 mRNA作为模板 ，采用，采用 Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成）或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以。再以 cDNA为模板进行为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。扩增，而获得目的基因或检测基因表达。p RT-PCR使使 RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA样品分析成为可能。样品分析成为可能。p 该技术主要用于：该技术主要用于： 分析基因的转录产物、获取目的基因、合成 cDNA探针、构建 RNA高效转录系统。原原 理理/sfzx/1. 鼠白血病病毒（ MMLV）反转录酶 ：有强的聚合酶活性， RNA酶 H活性相对较弱。最适作用温度为 37 。在长时间的逆转录过程中，不会造成模板的降解，获得 cDNA的几率大，适用于较长的 cDNA链的合成。 2. 禽成髓细胞瘤病毒（ AMV）反转录酶 ：有强的聚合酶活性和 RNA酶 H活性。最适作用温度为 42 。3. Thermus thermophilus、 Thermus flavus等嗜热微生物的 热稳定性反转录酶： 在 Mn2+存在下，允许高温反转录 RNA，以消除 RNA模板的二级结构。4. MMLV反转录酶的 RNase H-突变体 ：商品名为 Superscript 和 SuperScript。此种酶较其它酶能多将更大部分的 RNA转换成 cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的 mRNA模板合成较长 cDNA。（一）反转录酶的选择 /sfzx/1. 随机六聚体引物：随机六聚体引物： 用此种方法时，体系中所有用此种方法时，体系中所有 RNA分子全部充当了分子全部充当了 cDNA第第一链模板，通常用此引物合成的一链模板，通常用此引物合成的 cDNA中中 96%来源于来源于 rRNA。2. Oligo(dT)： 是一种对是一种对 mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA具有具有 3端端 Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅尾，此引物与其配对，仅 mRNA可被转录。由于可被转录。由于 Poly(A+)RNA仅仅占总占总 RNA的的 1-4%，故此种引物合成的，故此种引物合成的 cDNA比随机六聚体作为引物和得到的比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。在数量和复杂性方面均要小。3. 特异性引物：特异性引物： 是用含目标是用含目标 RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的物仅产生所需要的 cDNA，导致更为特异的，导致更为特异的 PCR扩增。扩增。 （二）引物的选择（二）引物的选择 /sfzx/（三）内参的设定（三）内参的设定p 为了保证实验结果的可靠与准确，可在为了保证实验结果的可靠与准确，可在 PCR扩增目的基因时，加入扩增目的基因时，加入一对内参照基因的特异性引物，同时扩增内参一对内参照基因的特异性引物，同时扩增内参 DNA，作为对照。，作为对照。p 常用的内参有常用的内参有 GAP