氨基酸和蛋白质一级结构

1氨基酸和蛋白质的一级结构1.1 蛋白质是由二十种不同的氨基酸构成的1.1.1 二十种氨基酸可以按其侧链分类1.1.2氨基酸的离子状态取决于环境的 pH1.1.3 使用离子交换层析可将各种氨基酸分开1.1.4 氨基酸可进行特征的化学反应1.2蛋白质中的氨基酸是通过肽键连接的 1.3肽可以化学合成1.4蛋白质可以通过各种生物化学技术纯化1.4.1柱层析常用于蛋白质的分离纯化1.4.2电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移率1.5蛋白质的一级结构就是蛋白质的氨基酸序列1.5.1蛋白质的氨基酸组成可以定量确定1.5.2 Edman降解方法常用于氨基酸序列的测定1.5.3大蛋白被水解成肽段后再测序1.5.4蛋白质一级结构的比较可以揭示进化关系1.1 蛋白质是由二十种不同的氨基酸构成的蛋白质是由氨基酸构成的聚合物，所有生物都是利用这 20种氨基酸作为构件组装成各种蛋白质分子的。因此这 20种氨基酸被认为是通用的或是标准的氨基酸。尽管氨基酸的种类有限，但由于氨基酸在蛋白质中连接的次序以及氨基酸数目的不同，所以可以组装成几乎无限的不同种类的蛋白质。20种氨基酸都被称之 -氨基酸，因为 -氨基酸分子中的 -碳（分子中第 2个碳， C） 结合着一个氨基和一个酸性的羧基，此外 C还结合着一个 H原子和一个侧链基团（用 R表示）。每一种氨基酸的 R都是不同的，侧链上的碳依次按字母命名为 、 、 和 碳，分别指的是第 3、 4、 5和 6位碳。表 1.1 20种标准氨基酸的英文名称及简写符号1.1.1 20种标准氨基酸可以按其侧链分类20种氨基酸按照它们的侧链基团可以分为： 6种脂肪族、 3种芳香族、 2种含硫、 2种羟基、 3种碱性、 2种酸性和 2种酰胺氨基酸。1、 R为脂肪族基团的氨基酸甘氨酸的结构在 20种氨基酸中最简单，因为它的侧链是个氢原子，所以 甘氨酸的 -碳不是手性碳 。 丙氨酸（ -氨基丙酸） 的侧链是一个简单的甲基；缬氨酸（ -氨基异戊酸） 的侧链是一个含有支链的 3碳侧链； 亮氨酸（ -氨基异己酸）和异亮氨酸（ -氨基 - -甲基戊酸） 都是含有支链的 4碳侧链。要注意的是， 异亮氨酸分子中的 -碳和 -碳都是不对称碳。所以异亮氨酸存在着 4种可能的立体异构体 ： L-异亮氨酸， D-异亮氨酸， L-别构异亮氨酸，和D-别构异亮氨酸（别构是指一个异构形式），脯氨酸（ -吡咯烷基 -羧酸） 明显地不同于其它 19种氨基酸，它有一个环形的饱和烃侧链，结合在 -氨基的氮和 -碳上。所以严格地讲，脯氨酸是一个亚氨基酸，因为它含有一个二级氨基，而不是一级氨基。不过在蛋白质中发现的脯氨酸也象其它氨基酸一样，它的 -碳也是手性碳。脯氨酸的杂环吡咯烷环限制多肽的几何构型，有时会在多肽链中引进一个转折的变化。2、 R为芳香族基团的氨基酸苯丙氨酸（ -氨基 - -苯丙酸） 是一个含有苯基的氨基酸。 酪氨酸（ -氨基 - -对羟基苯丙酸） 的结构类似于苯丙氨酸，称之对羟基苯丙氨酸。酚是个比较弱的酸，所以酪氨酸侧链的 pKa值为 10.5。 色氨酸（ -吲哚 -氨基丙酸） 的侧链带有一个双环的吲哚基，所以色氨酸又称之 吲哚丙氨酸。三种芳香族氨基酸都吸收紫外光，在中性 pH条件下，色氨酸和酪氨酸的紫外吸收峰在 280nm， 而苯丙氨酸的在 260nm， 大多数蛋白质中都含有色氨酸和酪氨酸或其中的一种，所以溶液中 280nm吸收的测量常用来估算蛋白质的浓度。3、 R为含硫基团的氨基酸蛋氨酸和半胱氨酸是两个含硫氨基酸。 蛋氨酸（ -氨基 - -甲硫基丁酸） 是个疏水氨基酸，它的侧链上带有一个非极性的甲基硫醚基，不过其中的硫原子是亲核的。 半胱氨酸（ -氨基 - -巯基丙酸） 侧链上含有一个巯基（ -SH）， 所以又称之巯基丙氨酸。虽然半胱氨酸的侧链显得有点疏水性，但 -SH也是一个高反应性的基团。4、 R为含醇基基团的氨基酸丝氨酸和苏氨酸是两个侧链含有 -羟基的不带电荷的氨基酸：苏氨酸（ -氨基 - -羟基丙酸）、丝氨酸（ -氨基 - -羟基丁酸）。 尽管丝氨酸的羟甲基（ -CH2OH） 在水溶液看不出离子化，但这个醇可以参与很多酶的活性部位反应，就象已被离子化了一样。要注意，苏氨酸也象异亮氨酸一样，具有两个手性碳原子，即-碳和 -碳原子，通常出现在蛋白质中的 L-苏氨酸只是 4种立体异构体中的一种，5、 R为碱性基团的氨基酸有 5种氨基酸在 pH7时它们的侧链基团带有电荷，其中有 3种是带正电荷的碱性 R基团，另外 2种是带负电荷的酸性 R基团。组氨酸、赖氨酸和精氨酸它们都带有亲水性的含氮碱基 R基团。 组氨酸（ -氨基 - -咪唑基丙酸） 的侧链有一个咪唑环，所以又称之咪唑丙氨酸。咪唑基是可以离子化的（ pKa 6.0）。 赖氨酸（ ,-二氨基己酸） 是一个双氨基酸，含有 -和 -氨基。在中性 pH， -氨基是以碱性氨离子（ -CH2-NH3 ） 形式存在的，在蛋白质中通常带正电荷。 精氨酸（ -氨基 - -胍基戊酸） 是 20种氨基酸中碱性最强的氨基酸，它的侧链胍基离子的 pKa值最高（ pKa 12.5）。6、 R为酸性基团的氨基酸天冬氨酸（ -氨基丁二酸）和谷氨酸（ -氨基戊二酸） 是二羧基氨基酸，除了含有 -羧基外，天冬氨酸还含有 -羧基，谷氨酸还含有 -羧基。由于两个氨基酸的侧链在 pH7时都离子化了，所以在蛋白质中是带负电荷的，这两个氨基酸经常出现在蛋白质分子表面上，谷氨酸的单钠盐是调味品味精。7、 R为含酰胺基团的氨基酸天冬酰胺（ - 氨基 - 羧基丙酰胺 ）和谷氨酰胺（ -氨基 - -羧基丁酰胺 ） 分别是天冬氨酸和谷氨酸的酰胺化产物。尽管这两个氨基酸的侧链是不带电荷的，但它们的极性很强，也经常出现在蛋白质分子的表面，它们可以和水相互作用。另外这两种氨基酸的酰胺基可以与其它的极性氨基酸的侧链上的原子形成氢键。必需和非必需氨基酸：以上氨基酸分类完全是根据侧链的性质分类的，从营养学角度又可将氨基酸分为必需和非必需氨基酸。 必需氨基酸包括赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸和精氨酸 ，其中组氨酸和精氨酸，人虽然能合成，但效率低，尤其在婴幼儿时期，需要由外界供给。 非必需氨基酸是其余的 10种氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸和丙氨酸。56781.1.2氨基酸的离子状态取决于环境的 pH表 1.2 给出了 25 下游离氨基酸的酸性和碱性基团的 pKa值和氨基酸的等电点（ pI）。氨基酸的 -COOH基是个弱酸，利用 Henderson-Hasselbalch方程可以计算任何pH下离子化基团的比例。共轭碱pH pKa log 弱酸从表 1.2可以看出，游离氨基酸的 -COOH的 pKa值的范围是 1.8至 2.5。对于一个典型的氨基酸它的 -COOH的 pKa值大约是 2， 羧酸盐对羧酸的比是 100000 :1，所以在中性 pH条件下，占优势的成分是羧酸盐离子。 RCOO 7.0 2.0 log RCOOH-氨基的 pKa值的范围是 8.7至 10.7。 它的共轭碱（游离的胺 -NH2） 对共轭酸（质子化的胺 -NH3 ） 的比，在 pH7时为 1:1000。 计算表明，在中性 pH条件下，游离氨基酸主要是以兼性离子形式存在的。 所以将一个氨基酸画成带有 -COOH和 -NH2基团的形式是不合适的。因为不存在这样一种 pH， 即在这一pH下， -COOH和 -NH2都占优势。脯氨酸的氨基（ pKa 10.6） 在中性 pH条件下也是质子化的碱基形式，虽然侧链与 -氨基结合，脯氨酸在 pH7时仍是一种兼性离子。通过氨基酸的滴定曲线可以确定氨基酸的各个解离基团的 pKa值。图 1.4给出了丙氨酸和组氨酸的滴定曲线。丙氨酸有两个可解离基团， -COOH和 -NH3 ， 它们的 pKa值分别是 2.4和 9.9，每一个值都是位于滴定曲线缓冲区的中心。组氨酸有 3个可解离基团，即 -COOH、 -NH3 和侧链基团咪唑基， pKa值分别是 1.8、 6.0和 9.3，也都是处于缓冲区的中心。1.1.3 使用离子交换层析可将各种氨基酸分开层析（ chromatography） 也称之色谱（来自 Chroma）， 其基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，样品中的各个成分与固相进行着不同程度的相互作用，使得样品中的各个成分在固相中的迁移率产生了差别，从而达到分离样品的目的。根据固相与样品中各个成分之间相互作用的种类的不同， 又有离子交换层析、分子筛层析和吸附层析等各种层析方法。 通常都是将固相装到一个柱子里，然后使流动相流过柱子（有时需要加压力），这样的层析方法叫做柱层析（ column chromatography）。如果被分离的样品中各个成分受溶液 pH的影响，有时带正电荷，有时带负电荷，此时就可利用离子交换层析方法进行样品的分离。离子交换层析的固相是离子交换体，其中有离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。 通常是以树脂、或是纤维素、或是葡聚糖作为基质，这些基质具有网状结构，将带电基团引入到基质上 托纬闪死胱咏换皇髦 菀 氲拇 缁 挪煌 址治 衾胱咏换惶搴鸵趵胱咏换惶濉 引入 SO3 Na 或 COO H 基团的叫做阳离子交换体；引入 N （ C2H5） Cl 基团的叫做阴离子交换体。分离氨基酸常用的是带有耐酸性非常强的磺酸根 SO3 Na （ 以盐的形式出现）的强阳离子交换树脂。首先将这种树脂填充到柱子中，然后注入含有样品的流动相，样品中含有阳离子成分 X ， 通过静电吸引，与树脂中的带电基团相互作用，结果 X 与 Na 交换，即发生阳离子交换后，形成 SO3 X。1.1.4 氨基酸可进行特征的化学反应氨基酸的 -氨基、 -羧基以及氨基酸的各种侧链基团可进行很多种化学反应。 氨基酸与茚三酮（ ninhydrin） 的反应是一个检测和定量氨基酸和蛋白质的重要反应。 茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热， 所有具有游离氨基的氨基酸都生成紫色化合物（ 470） （图 1.7）。然而由于 脯氨酸是一个亚氨基酸，所以与茚三酮反应生成的是黄色化合物（ 440） 。有几种与氨基酸的氨基反应的试剂常用来鉴定蛋白质和多肽的 N-末端氨基酸残基。2,4-二硝基氟苯（ 2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB） 也叫做 Sanger试剂 。DNFB在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物 二硝基苯基氨基酸 （ dinitro phenyl amino acid, DNP氨基酸 ）（图 1.8a）。丹磺酰氯（ dansyl chloride） 是 5-二甲基氨基萘 -1-磺酰氯（ 5-dimethylaminonaphthalene-1 -sulfonyl chloride） 的简称。丹磺酰氯与氨基酸反应生成荧光性质强和稳定的磺胺衍生物 （图 1.8b）， 也常用于多肽链的 N末端氨基酸的鉴定。苯异硫氰酸酯（ phenylisothiocyanate, PITC） 在弱碱性条件下，与氨基酸反应生成苯乙内酰硫脲（ phenylthiohydantoin, PTH） 衍生物，即PTH-氨基酸（图 1.8c）， 此反应又称之 Edman反应，该反应是蛋白质或多肽氨基酸序列测定常用的反应 。1.2蛋白质中的氨基酸是通过肽键连接的一个氨基酸的 -羧基与另一个氨基酸的 -氨基缩合，通过形成的酰胺键将两个氨基酸连接在一起，这个酰胺键称之肽键（ peptide bond）（ 图 1.9），氨基酸缩合生成的产物称之肽（ peptide）。1.3肽可以化学合成多肽合成的基本过程是本世纪初由 Emil Fischer设计的，称为液相合成法，肽链从 N端向 C端方向延伸。首先一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基被保护基团封闭，然后参与肽键形成的羧基被激活，如形成脂酰氯，或酸酐。激活的羧酸受到游离氨基的亲电攻击形成一个封闭的二肽（图 1.11）。最后通过水解有选择地除去保护基团而留下一个完整的肽键 。1.4蛋白质可以通过各种生物化学技术纯化利用蛋白质的溶解度、净电荷、大小以及与配体结合特异性上的微小差异。有透析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、电泳（垂直板电泳、等电聚焦电泳、双向电泳）等分离纯化方法。 透析离子交换层析离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的 pH条件下，其带电状况也不同。 阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。凝胶过滤层析（ Gel-filtration chromatography）凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。单个凝胶珠本身象个 “筛子 ”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。C 亲和层析（ Affinity chromatograph