5、生物制品制造新技术(2)(公开课)

第二节、生物技术诊断制剂 重组表达抗原 (Recombinant antigen) 核酸图谱分析 (Atlas of Nucleic Acid) 核酸探针 (Nucleic acid probe) 聚合酶链反应 (PCR) 基因芯片 (Gene chip)一、重组表达抗原n 基因工程重组表达抗原是用 DNA重组技术 ，将编码特定抗原 的基因插入原核或真核表达质粒，再转入宿主中使其高效表达，然后运用生物化学分离、纯化技术，提取表达产物等，最终制成 诊断 用重组表达抗原。高特异 、 高纯度 、 均质性好 、 重复性强成本低并可大量生产常规方法无法制备的抗原高危险病原优点二、核酸图谱分析n 核酸电泳图谱n 核酸酶切图谱n 寡核苷酸指纹图谱（一）核酸电泳图谱分析n 1、质粒图谱分析质粒相对稳定性细菌分型、流行病学调查简便、特异、快速、可靠缺点：一些细菌无质粒或质粒不稳定质粒相对分子质量相同而核苷酸序列不同的菌株无分辨能力n2、 RNA电泳图谱分析分节段 RNA病毒不同病毒或相同病毒不同毒株比较reovirus禽流感： 8个片段 RNA呼肠孤病毒： 10 12 个节段轮状病毒： 11个节段(二 ) 核酸酶切图谱分析染色体 DAN、质粒 DNA或 RNA经反转录形成的 cDNA，经限制性内切酶切割产生的不同片段，经琼脂糖电泳后可形成不同的带型，即核酸酶切图谱，又称 DNA指纹 。用于比较 不同病原体基因组 的差异，了解它们之间的遗传关系RFLP（限制性酶切片段长度多态性）细菌基因特征的重要指标与 核酸杂交 技术联合使用更有利于判断和解释（三）寡核苷酸指纹图谱分析将 纯化 的 RNA经一种特殊的 RNA酶（通常为 T1酶 ）消化后，产生许多理化特性和大小不同的寡核苷酸片段，经 PAGE双向 电泳分离后进行放射自显影，形成类似指纹的图谱，即 寡核苷酸指纹图谱 （Oligonucleotide fingerprinting ） 。抗原变异分析疫苗株与野毒株的鉴别分析同源性和变异性，有助于研究病毒的变异趋势，跟踪毒株的来源，扩散途径及目前的优势流行株，有助于爆发流行的预测三、核酸探针用 放射性同位素 、 地高辛 或 生物素 等标记核酸分子或其它一条链作为核酸探针，与处理样本中存在的互补链结合为双链，该反应称 核酸杂交 或 分子杂交 。Southern blot DNANorthern blot RNA应用：难以培养的病原体检测牛白血病、猪痢疾、牛和猪钩端螺旋体病、牛副结核转印杂交 （ transfer hybridization ）原位杂交（ in situ hybridization ）DNA 样品DNA 探针变性X-ray 片限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳转移印迹胶 膜两部分工作标记杂交暴光聚合酶链式反应 （ PCR）RTPCR 原位 PCR荧光 PCR巢式 PCR定量 PCR定性、定量、定位假阳性、假阴性可重复性反向 PCR不对称 PCR重组 PCR多重 PCR免疫 -PCR PCR的反应体系五、基因芯片（ Gene chip）将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为 探针 ，有规律地排列固定于支持物上，然后与待检测样品中的基因按 碱基配对原理 进行 杂交 ，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作比较和检测，从而迅速得出所要的信息。arrayer microarray BiologicalSampleAnalyze data Scanner“Hybridize”DNA芯片技术流程DNA芯片技术的应用领域生物战剂检测临床疾病的基因诊断法医学鉴定药物研究开发动植物检疫基因组研究后基因组计划生物信息学DNA芯片第三节、抗体工程技术 单克隆抗体 基因工程抗体 催化抗体一、单克隆抗体单克隆抗体 ：由一个 B细胞分化增殖的子代细胞（浆细胞）产生的针对 单一抗原决定簇 的抗体。特性 多抗 单抗对免疫原性要求 免疫原纯度高，抗体纯度才高 用不纯的免疫原可得高纯单抗抗体产生细胞 多克隆性 单克隆性同质性 高度异质 高度同质特异性 较高，与抗原上多种决定簇结合 高，与特定决定簇结合稳定性 较好 相对较差，对理化条件敏感标准化 较难，不同批次的抗体质量差异较大易于标准化，批次间差异较小交叉反应 很常见，难避免非特异反应 不常见，可避免非特异反应沉淀反应 有 大多数没有杂交瘤技术制备单抗将经预定抗原免疫的 淋巴细胞 与失去次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（ HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶（ TK）合成能力的 骨髓瘤细胞 系融合，产生杂交瘤细胞，经过培养，筛选或克隆化，获得既能分泌针对预定抗原的单抗又有无限繁殖能力的杂交瘤细胞系，这就是 淋巴细胞杂技瘤技术 （ lymphocyte hybridoma technology）。1、 B细胞的制备 ：提纯的抗原免疫 Balb/c或其它品系的纯系小鼠，取小鼠脾脏，制备 B细胞2、骨髓瘤细胞的制备 ：相同来源小鼠的骨髓瘤细胞，营养缺陷，不能在 HAT培养基上生长3、饲养细胞的制备 ：小鼠胸腺细胞、腹腔巨噬细胞等4、 HAT培养基筛选杂交瘤的原理小鼠脾细胞小鼠骨髓瘤细胞A BPEG未融合的 A 相互融合的 A A与 B融合 相互融合的 B 未融合的 BHAT选择培养液中培养HGPRT+ TK+ HGPRT+ TK+ HGPRT 或 TK代谢完整但不能连续培养 代谢完整并能连续培养 代谢缺陷细胞死亡 细胞存活并增殖细胞死亡H: 次黄嘌呤A：氨基喋呤T：胸腺嘧啶核苷5、细胞融合 ：脾细胞与骨髓瘤细胞按一定比例混合，离心后吸尽上清液，然后缓慢加入融合剂 50 PEG。静置 90S，逐渐加入 HAT培养基，分于加有饲养细胞的 96孔细胞培养板孔中，置 5 10 CO2培养箱。6、杂交瘤细胞的筛选 ：血清学方法检测各孔抗体 筛选阳性抗体7、杂交瘤细胞的克隆化： 尽早克隆化，反复克隆 3-5次使杂交瘤细胞稳定有限稀释法显微操作法软琼脂平板法： 458、杂交瘤细胞的冻存 ：加入 DMSO分装于小安瓿内保存于液氮中9、单抗的生产 ：动物体内生产系统：小鼠腹腔，收腹水，腹腔注射液体石蜡或降植烷，刺激腹水产生细胞培养产生系统：单层细胞培养或悬浮培养。关键：提高培养液中的细胞密度（四）单克隆抗体的应用1.血清学技术： 可取代原有的多克隆抗体，用于传染病的诊断及病原的分型，避免了多克隆抗体引起的交叉反应。提高检测生物活性物质水平2.免疫学基础研究 ：促进抗体结构的进一步探讨，淋巴细胞 CD及细胞组织相容性抗原的分析3.肿瘤治疗 ：肿瘤特异性抗原的单抗，与药物或毒素连接制成免疫毒素，又称生物导弹4.抗原纯化 ：亲和层析柱，提取抗原；基因工程疫苗筛选保护性抗原成分或决定簇二、基因工程抗体n 用基因工程技术制备抗体分子，这种抗体分子称为 基因工程抗体 （ genetic engineering antibody）。 嵌合抗体 （ chimeric antibody） 重构抗体 （ reshaping antibody） 单链抗体 （ single-chain antibody） Ig相关分子 噬菌体抗体 （ phage antibody） 全套抗体 （ the immunoglobulin repertoire）基因库嵌合抗体 （ chimeric antibody）n 嵌合抗体 是指在同一抗体分子种含有 不同种属来源 抗体片段的抗体，又称杂种抗体。“鼠人 ”型重构抗体（ reshaping antibody）n 在嵌合抗体的基础上，进一步将鼠 Ab超变区基因嵌入人抗体 Fab骨架区的编码基因中，再将此 DNA片段与人 Ig恒定区基因相连，然后转染杂交瘤细胞，使之表达嵌合的 V区抗体。 在人抗体可变区序列内嵌入鼠源抗体的高变区基因序列，通过这种置换为人类抗体提供了一个新的抗原结合部位。单链抗体 （ single-chain antibody）单链抗体单链抗体 (ScFv)是由是由 VH和和 VL通过连接肽（通过连接肽（ 接头接头 ）重组并表达而）重组并表达而成的另外一种小分子抗体。成的另外一种小分子抗体。具有较好的具有较好的 抗原结合能力抗原结合能力 ，且，且 分子量小分子量小 、 穿透力强穿透力强 、 体内循环半体内循环半衰期短及免疫原性低衰期短及免疫原性低 等特性。等特性。在此基础上，可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分在此基础上，可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体等的理想而基本的元件子，是构建免疫毒素和双特异抗体等的理想而基本的元件 。Ig相关分子n 将抗体分子的部分片段（如 V区或 C区）连接到与抗体无关的序列上（如毒素），就可创造一些 Ig相关分子。“生物导弹 ”， 毒素取代 Fc,通过高变区结合特异抗原，连接上的毒素可直接运送到靶细胞表面噬菌体抗体 （ phage antibody）n 通过通过 PCR将全套人抗体重链和轻链将全套人抗体重链和轻链 V区区基因克隆出来，并在噬菌体表面表达、基因克隆出来，并在噬菌体表面表达、分泌，经筛选后获得特异性抗体。分泌，经筛选后获得特异性抗体。 噬菌体表面展示技术噬菌体表面展示技术 （ phage display t