8-目的基因的pcr扩增及其扩增产物的鉴定

目的基因的 PCR扩增及其扩增产物的鉴定分析 综合性设计性实验 -8此实验共包括如下六个部分1. 第一部分，目的基因选择2. 第二部分， PCR引物设计3. 第三部分， PCR实验操作4. 第四部分， PCR产物电泳鉴定5. 第五部分， PCR产物测序鉴定6. 第六部分，目的基因序列变异分析 PCR与临床诊断 NGAL（ neutrophil gelatinase-associated lipocalin）即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，是脂质运载蛋白（ lipocalin) 家族的一个成员。 NGAL基因的蛋白产物具有保护调节基质金属蛋白酶 -9的活性，作为小分子铁配合物结合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应等功能。另外， NGAL作为一种早期标志物还可以帮助判定缺血性肾损伤程度。 NGAL的 mRNA信息在 NCBI核酸数据库中有来自不同实验室登记的多个版本，包含完整编码区的有 BC033089和 NM_005564等，编码区长为 597 bp，编码 198个氨基酸，包含了 N端前部长为 20个氨基酸的信号肽序列（为核酸序列的 1-60 bp）。NGAL 基因第一部分，目的基因选择NGAL核酸编码区序列及其相应的蛋白序列 ：前 20个 AA为信号肽序列第二部分， PCR引物设计引物决定了 PCR产物的长度和特异性。目前有多种引物设计软件，如 primer premier5、Oligo和北京军事医学科学院李伍举教授开发的 Biosun等， Internet免费引物设计网站有primer 3， Primerfinder等。引物设计有以下几个原则：（ 1）引物的特异性。引物应根据目的序列进行设计，引物与非靶序列之间不要超过 70的同源性或连续 8个的碱基互补，减少非特异产物；（ 2）引物的长度。一般指引物中能与模板序列互补结合的部分，不包括在 5 端额外增加的酶切位点序列和其他序列。引物长度以 18 24 bp为佳。（ 3）引物 3末端的碱基。引物 3末端是延伸的始端，碱基错配会影响延伸效率。当最后一个碱基是 A时，容易发生错配，所以引物 3末端最好不要为 A；（ 4）引物的 G+C含量一般为 40 60，过高或过低都不利于引发反应；（ 5）两条引物不能形成稳定的二聚体，或引物自身不能形成稳定的二级发夹结构，这些都会影响引物与模板的结合。（ 6）两条引物的融解温度 Tm值尽量不要相差太大，引物的 Tm值粗略计算公式为 Tm = 4 （G+C） +2（ A+T）；（ 7）引物的 5端对扩增特异性没有影响，因此可以被修饰而不影响扩增的特异性，引物 5端修饰包括加酶切位点、标记生物素和荧光等，引物 3端是延伸的开始，不能进行任何修饰。 了解并掌握 PCR基因扩增的基本原理 熟悉 PCR基因扩增技术的具体操作过程 实验目的第三部分， PCR实验操作一、概述 PCR：使用一对寡核苷酸引物，以目的序列为模板，利用 DNA合成 酶和四种脱氧核糖核酸进行 DNA的体外合成反应。 PCR技术具有灵敏度高，特异性高、操作方便和重复性好等特点，能够在几个小时内获得多达几百万拷贝的目的基因。 该技术在上个世纪 80年代中期由美国 K.Mullis发明建立，经过近二十年已发展成包括多种衍生技术，在很多领域中广泛使用， K.Mullis也因此获得 1993年度的诺贝尔化学奖。二、 PCR基本原理 DNA在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程，是 DNA聚合酶、DNA连接酶、引发酶、 RNA引物、四种脱氧核糖核酸、 DNA超螺旋酶、离子环境等多成份参与的过程。 PCR是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的 DNA复制，所以在一个 PCR中必需成分是1. 模板 DNA2. DNA聚合酶3. 四种脱氧核糖核酸4. 正向和反向两条引物5. 适当的缓冲体系。 模板序列：待扩增的 DNA序列，一般为双链的 DNA可包括线形双螺旋 DNA，如基因组 DNA，及闭环双链 DNA，如质粒； 模板的来源很广，如从细胞 /细菌中提取基因组 DNA、提取 mRNA经反转录得到cDNA、质粒、病毒等； 每个反应中模板的量为 1 ng 1 g。质粒 DNA和纯化的 DNA的量可少一些，而基因组 DNA的量应多一些。 PCR灵敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否则会导致 PCR的非特异性扩增。1、模板 DNA 引物（ primer）也称为寡核苷酸引物，常规的 PCR反应需要两种引物，分别成为 5端引物和 3端引物，或称为正向引物和反向引物。 通常 DNA及 mRNA序列的写法为 53 ，所以 5端引物与目的序列的 5末端序列相同，而3端引物与目的序列的 3末端序列反向互补。2、引物 它们作为 DNA扩增的起始部分，能限定待扩增 DNA序列的长度。 为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应至少有 15 18 bp。55335533上游引物下游引物 DNA聚合酶：以 DNA为模板，以脱氧核糖核酸为底物催化合成新的 DNA的一种酶。 早期的 PCR反应使用的 DNA聚合酶为大肠杆菌 DNA聚合酶 I的 Klenow片段。但该酶在高温下容易失活，需要在每次合成反应进行时候再加入一份酶。 随着新的耐热 DNA聚合酶的发现及在 PCR反应中的应用，使 PCR操作更方便，产量更稳定。 目前商品化的 DNA聚合酶有 Taq DNA聚合酶和 Pfu DNA聚合酶。 Taq DNA聚合酶最适工作温度为 75-80 。该酶具有 53 聚合酶活性，在镁离子存在情况下可催化核苷酸沿 53 方向发生聚合反应。3、 DNA聚合酶4、脱氧核糖核酸 四种脱氧核苷三磷酸即 dATP、 dTTP、 dCTP和 dGTP，为 PCR反应中 DNA合成原料。 在新的一个反应体系中，这四种脱氧核糖核酸的起始浓度应该都相等，如果其中一种的浓度明显不同于其他的就会诱发错配，并降低新链合成速度。 缓冲液提供 PCR反应所必需的合适酸碱度与离子环境。主要成分有 KCl、 Tris-Cl和 MgCl2。 其中 Mg2 的浓度最重要，它能影响 DNA聚合酶的活性，以及模板与 PCR产物的解链温度。5、缓冲液1. 变性：是指模板的热变性，双螺旋模版 DNA成为单链的 DNA分子；在应用 Taq DNA聚合酶进行 PCR反应时，变性往往在 94 95 条件下进行。这也是 Taq DNA聚合酶进行30个左右的 PCR循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。2. 退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物的熔解温度低 5 10 ， PCR实验要对退火温度进行优化。二、 PCR基本步骤3. 延伸：在镁离子存在条件下， DNA聚合酶按碱基互补原则，催化四种脱氧核糖核酸加在引物的 3端，使引物沿 53 方向生成与模版 DNA互补的新 DNA链。双链模版 DNA变性退火535 355 3355335533上游引物下游引物延伸 3553355 3多次循环（ 2n 拷贝）下面为一个典型的 PCR循环参数设置：备注： * 比两条引物的 Tm值 低 510 。94 5 min 94 30 s X * 30 s 72 1 kb/min 72 5 min25-35个循环三、影响 PCR因素 虽然 PCR操作很方便，但影响因素也很多，从而影响 PCR的特异性和高效性。1. 引物2. 变性温度和时间3. 退火温度和时间4. 延伸温度和时间5. 循环次数 引物决定了 PCR产物的长度和特异性。 引物的设计要求请看本实验讲义 “引物设计 ”部分。1、引物 在 PCR反应刚开始时，为保证作为模板的双链 DNA完全变性成单链 DNA，一般设为95 、 5 min；在随后的循环中，可设为 95 、 30s。 有些模板 DNA的 G+C含量较高，变性温度就越高。太高的变性温度和太长的变性时间会影响 DNA聚合酶的活性。2、变性温度和时间 退火温度与引物的 Tm值相关，一般比 Tm值低 510 。 退火温度设置过低，会导致非特异性扩增；退火温度过高，则影响引物与模板的结合而降低 PCR效率。 在退火时间里，引物与模板相结合，时间太短会使引物与模板未完全结合而导致无法延伸；时间过长容易产生引物在模板上的非特异性结合或形成引物二聚体。退火时间设置为 30s基本上就足够了。3、退火温度和时间 所用 DNA聚合酶的最佳活性温度决定了延伸温度，如 Taq聚合酶的最佳温度为 7080度，所以延伸温度设为 72 即可。 在实践中 Taq DNA聚合酶的延伸效率约为 500 bp/30 s，若待扩增的片段较长，可适当延长时间，但时间过长又会致非特异性扩增。4、延伸温度和时间 在经过一定的循环次数后，随着聚合酶活性的降低，引物浓度降低等因素， PCR产物不再呈指数增加，此时称为平台效应。 循环次数设为 2530次，即可满足一般的分子生物学实验要求。过多的循环次数会导致碱基错配增加和非特异性扩增的出现。5、循环次数1. DNA模板：以 pPIC9-NGAL为模板，来扩增不包含信号肽序列的 NGAL编码区2. 引物：PCR上游引物（ P1）： 5-CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA -3PCR下游引物（ P2）： 5-CGGAATTCTCAGCCGTCGATACACTGGTC -3底下有横线的碱基为酶切位点： XholI (P1)， EcoRI(P2)3. 2Taq PCR Master Mix （广州佰路生物科技有限公司生产，产品成份为：0.1 U Taq DNA Polymerase/ml500 mM dNTP each50 mM Tris-HCl (pH8.7)20 mM KCl4 mM MgCl2 4. 无菌水5. 100bp plus ladder DNA marker本实验所用试剂实验操作95 2min94 30s60 30s 72 30s72 5min30个循环1. 按以下次序将各成分加 PCR管中。2Taq PCR MasterMix 5 lP1 (12.5 M ) 1 lP2 (12.5 M) 1 l无菌水 2 lpPIC9-NGAL 1 l 反应体系： 10 l混匀，稍加离心并标记。2. PCR反应于 ABI 2720 Thermer cycler进行， PCR反应条件： 凝胶准备 称 1g琼脂糖置三角瓶中，加 100ml 1TAE； 微波炉加热大约 2分钟，熔化琼脂糖； 熔化的琼脂糖自然冷却到 60 70 时，加入 EB 5l， 并轻轻混匀。 胶床准备 将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有 1mm的间隙； 将胶床放在调整好的水平台上； 铺胶：将冷却致 60 的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度约 5 mm； 室温下静置 30分钟左右，凝胶固化。将带凝胶 的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极；第四部分，