基因扩增及其相关检测技术11.2ppt

四川省临床检验中心杜 琼2002、 11各 位 同 道：基因扩增及其相关检测技术 PCR的基本原理 PCR反应的基本条件 PCR的影响因素 PCR扩增产物的分析法 PCR反应相关检测技术 其它基因扩增检测技术PCR 反应的基本原理 聚合酶链反应 （ PCR） 又称无细胞 分子克隆系统 体外酶促基因扩增法。 PCR技术是由 Mullis等于 1985年发明创造的。该技术可将极微量的靶 DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对 DNA分子的分析和检测能力 。 PCR技术能检测单分子 DNA或对每 10万个细胞中仅含 1个靶 DNA分子的样品。 自 1985年 PCR技术首先被应用于人 珠蛋白 DNA的扩增及镰刀状红细胞贫血病诊断以来，该方法被广泛应用于 微生物学、遗传学 (分子克隆、序列分析、基因突变 )、遗传病、传染病、法医判定和考古研究等多领域 。 由于 PCR具有 敏感性高、特异性强、快速、简便 等优点，已在病原微生物学领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景。因而发明人 Mullis获 1993年诺贝尔化学奖。目前研究者们已对该技术的某些程序进行了改革，使 PCR技术变得敏感、特异、简单、微量化、不易发生污染，使得 PCR技术在临床上迅速得以普及。 自 PCR发明以来，其它各种基因扩增检验技术如连接酶链反应（ LCR）、 自主序列复制系统（ 3SR） 和转录依赖的扩增系统（ TAS） 等相继出现，但 应用最为普遍的仍是 PCR技术。 PCR技术的基本原理： 类似于 DNA的天然复制过程，其 特异性 依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸 引物 。 PCR由 变性退火延伸 三个基本反应步骤构成： 模板 DNA的 变性 ： 模板 DNA经加热至93 左右一定时间后，模板 DNA双链或经 PCR扩增形成的双链 DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； l 模板 DNA与引物的 退火 （复性）：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至 55 左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合；l 引物的 延伸 ： DNA模板与引物结合在TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。l 重复循环 变性退火延伸 三过程，就可获得更多的 “半保留复制链 ”，这种新链又可成为下次循环的模板，每完成一个循环需 2 4分钟， 2 3小时 就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。l PCR 循环 第一步 加热变性靶序列靶序列（图 1）PCR 循环 - 第二步 引物与靶序列退火靶序列靶序列Primer 1Primer 253553533（图 2）PCR 循环 - 第三步 - 引物延伸靶序列靶序列Primer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase（图 3）第 1个 PCR 循环完成后 图图 4 得到两个拷贝的靶序列靶序列靶序列30次循环后靶序列扩增的数量No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon（图 5）二 、 PCR反应的基本条件 模板核酸 引 物 dNTP 缓 冲 液 Mg2+ 耐热 DNA聚合酶 温度和循环参数 石蜡油（一） 模板核酸 PCR以 DNA或 RNA为模板进行核酸的体外扩增。 RNA的扩增需先反转录成 cDNA后才能进行 PCR循环，核酸标本来源广泛，可以从纯培养的细胞或微生物中直接提取，也可以从临床标本、犯罪现场标本、病理解剖标本提取。无论标本来源如何，待扩增核酸都需要纯化，使核酸样品中不含 DNA聚合酶抑制剂。 PCR中模板加入量一般为 10210 5拷贝 的靶序列。 310 5单拷贝靶分子相当于 1g人基因组、 10ng酵母 DNA或 1ng大肠杆菌DNA。 1 M13噬菌体相当于 105靶分子。因此，扩增不同拷贝数的靶序列时，加入的含靶序列的 DNA量亦不相同。如真核rRNA基因有 200 500拷贝，反应中仅需加入 0.5 2ng人基因组 DNA即可。 模板核酸浓度 过底 ，扩增产物量少， 不易检出 ；模板核酸浓度 过高 ， 导致 扩增失败。（二）、 引 物 引物 是 PCR特异性反应的 关键。 PCR产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度。 PCR扩增产物的大小是由特异性引物限定的。因此，引物的合成与选择对PCR的成功与否有着决定意义。 一般每条引物的浓度 0.1 - 1mol/L ，以最低引物量产生所需要扩增产物的结果为好。（三）、缓 冲 液 PCR反应的缓冲液，为 Taq DNA聚合酶提供最适酶反应条件。 目前常用的缓冲体系为 10 -50 mmol/L Tris HCl。 pH8.3， Tris是一种双极性离子缓冲剂，要改变缓冲液的缓冲能力，可将 Tris浓度加大， pH8.9，会增加产物量。缓冲液加 100g/ mlBSA、 0.01%明胶、 0.05 0.1%吐温 20，有助于 Taq DNA聚合酶的稳定，尤其在扩增长片段时，加入这些试剂对 PCR是非常有益。 （四）、 Mg2+ Mg2+是 Taq DNA聚合酶活性所必需的， 它的浓度直接影响着 酶的活性、忠实性、引物的退火、模板与 PCR产物的解链温度、产物的特异性和引物二聚体的形成等。 PCR反应混合物中的 DNA模板、引物和dNTPs的磷酸基团可与 Mg2 结合，引物和模板 DNA原液中如含 EDTA等螯合剂也影响游离 Mg2 的浓度 。 因此， PCR反应中 Mg2的加入量要稍高 。 最好对每种模板、每种引物均进行 Mg2 的优化。Mg2 浓度过低，酶活性降低，过高导致非特异扩增。（五）、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP） dNTP： 四种脱氧核苷三磷酸 (dATP、dCTP、 dGTP、 dTTP)是 DNA合成的基本原料。 一般认为最适的 dNTP浓度为 50 200mol/L。 在此范围内， PCR产量、特异性与合成忠实性最佳，所用四种 dNTP浓度应相等，以使错误掺入率降至最低。 （六）、耐热 DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶： 是从水生栖热菌Thermus Aquaticus(Taq)中分离出的热稳定性 DNA聚合酶，该酶的最适温度很高（ 79 ），其活性半衰期： 92 2h; 95 ， 40min； 97.5 ， 5min， 。在PCR反应中，每 100l 反应液中含 1- 5U Taq DNA聚合酶为佳。 Taq DNA聚合酶具有依赖 DNA合成的、链置换的 53 外切酶活： 如果模板上有一段退火的、不能延伸的寡聚核苷酸阻断物时，它就会被外切酶活性逐个切除，如荧光 PCR的带有发光基团的探针 。 Taq DNA聚合酶具有反转录酶的活性， 类似于反转录酶，可以进行 RNA的反转录。 Taq DNA聚合酶具有 类似 DNA末端转移酶的功能， 可以在新合成双链产物的 3端加上一个非模板依赖的碱基。一般 A的结合力高于 G、 T、 C， 利用这种特性可以构建 dT-载体来克隆带 dA尾的产物。 Taq DNA聚合酶应低温下保存，不能反复动融。（七）、温度和循环参数1、 变性温度与时间PCR反应中模板 DNA的变性十分 重要。只有模板 DNA或 PCR产物的双链完全解开，才能有效的和引物结合，而这种结合是 PCR扩增的基础。变性温度越高、时间越长，变性就越充分。通常选用的变性温度为 95 ，时间 30s。 因模板DNA的链比较长，所以在 PCR反应中第一个循环变性最为重要，需时间较长。（ 5-10min ）。2、复性温度与时间变性温度是 PCR反应成败的关键，而复性温度决定着 PCR的 特异性 。温度 越低复性 越好 ，但容易出现引物与靶 DNA的错配，增加非特异性结合。温度太高不利于复性，大多数 PCR反应的复性温度在 55 左右。虽然复性时间不是决定PCR反应的关键因素，但复性时间过长会增加非特异的复性。时间 3040 秒。3、 延伸温度与时间l 不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性，也会影响其产量。 72 时，核苷酸的合成