生物制品概述1

生物制品概述细胞工程一、生物制品的定义n 生物制品：是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的 微生物、细胞及各种动物和人源 的组织和液体等生物材料制备、用于人类 疾病预防、治疗和诊断 的药品。 一、生物制品的定义n 我国人用生物制品包括以下 五类：n 疫苗 抗毒素及免疫血清n 血液制品 细胞因子n 体内及体外诊断制品及其他活性制剂（包括毒素、抗原、变态反应原、单克隆抗体、重组 DNA产品、抗原 -抗体复合物、免疫调节剂、微生态制剂等）。 二、生物制品的分类n 2.1 疫苗（ Vaccines） n 细菌类疫苗 （ Bacterial Vaccines）：也称 菌苗 ，由 细菌、螺旋体 或其衍生物制成，如卡介苗、伤寒 Vi多糖疫苗、破伤风疫苗（类毒素）等。 n 病毒类疫苗 （ Viral Vaccines） ：由 病毒、衣原体、立克次体或其衍生物 制成，如麻疹减毒活疫苗、重组（ CHO细胞）乙型肝炎疫苗等。n 联合疫苗 （ Combined Vaccines）：由 二种或二种以上疫苗抗原 配制成的具有 多种免疫原性 的灭活疫苗或活疫苗，如百日咳、白喉、破伤风联合疫苗（ DTP），麻疹、流行性腮腺炎、风疹联合疫苗（ MMR）等。 二、生物制品的分类n 2.2 抗毒素及免疫血清 （ Antitoxin and Antisera）n 由 特定抗原免疫动物 所得血浆制成的抗毒素或免疫血清，如破伤风抗毒素、抗狂犬病血清等，用于治疗或被动免疫预防。 二、生物制品的分类n 2.3 血液制品（ Blood Products） 由健康人的血浆或特异免疫人血浆分离、提纯或由重组 DNA技术制成的 血浆蛋白组分 或血细胞组分 制品，如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子（天然或重组的）、红细胞浓缩物等，用于诊断、治疗或被动免疫预防。 二、生物制品的分类n 2.4 细胞因子（ Cytokines）n 由健康人血细胞增殖、分离、提纯或由重组 DNA技术制成的 多肽类或蛋白质类制剂 ，如干扰素（IFN）、白细胞介素（ IL）、集落刺激因子（ CSF）、红细胞生成素（ EPO）等，用于治疗。 二、生物制品的分类n 2.5 诊断制品（ Diagnostic Reagents） n 体外诊断制品 ：由特定抗原、抗体或有关生物物质制成的免疫诊断试剂或诊断试剂盒 ，如伤寒、副伤寒、变形杆菌（ OX19、 0X2、 OXK）诊断菌液，沙门氏菌属诊断血清， HBsAg酶联免疫诊断试剂盒等。n 体内诊断制品 ：由 变态反应原 或有关抗原材料制成的免疫诊断试剂，如卡介菌纯蛋白衍生物（ BCG-PPD）、布氏菌纯蛋白衍生物（ RB-PPD）、锡克试验毒素、单克隆抗体等。二、生物制品的分类n 2 6其他制品（ Else Products） 由有关生物材料或特定方法制成、不属于上述5类的其他生物制剂，用于治疗或预防疾病。如治疗用 A型肉毒毒素制剂、微生态制剂和卡介菌多糖、 核酸制剂 等。 三、生物制品的命名n 命名原则 ：参照中国生物制品传统命名及WHO规程命名方式，制品的基本名称一般可由 三个部分 组成。 n （ 制法 或群、型别）（ 病名 、微生物名、组分、人名或 材料 ）（ 品种名即制品种类 ） n 例：重组（酵母）乙型肝炎疫苗 四、疫苗及疫苗制备技术n 1、疫苗的种类 n 已有的疫苗概括起来分为 活疫苗 、 灭活疫苗 、代谢产物和 亚单位疫苗 以及 生物技术疫苗 ，其中生物技术疫苗又分基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗、抗独特型疫苗，基因工程活疫苗以及 DNA疫苗等。四、疫苗及疫苗制备技术n （ 1）活疫苗 简称活苗，有 强毒苗、弱毒苗和异源苗 三种。n 强毒苗 是 应用最早 的疫苗种类，使用强毒进行免疫有较大的危险，非情况特殊 不予使用 。n 弱毒苗 是目前使用的 最广泛 的疫苗，弱毒苗的 毒力已致弱 ，仍 保持原有抗原性，并能在体内繁殖 ，用较少剂量诱导产生坚实的免疫力。 有些 弱毒苗可 刺激产生干扰素 ，可抵抗其他野毒的感染。弱毒苗有的可能散毒，而且保存期较短，将其制成 冻干苗 可延长保存期。n 异源苗 是用具有 共同保护性抗原 的 不同种微生物 制备成的疫苗。如用鸽痘病毒预防鸡痘等。四、疫苗及疫苗制备技术n （ 2）灭活疫苗 ：病原微生物 经理化方法灭活 后，仍然 保持免疫原性 ，接种后使动物产生特异性抵抗力，这种疫苗称为灭活疫苗（死苗）。n 缺点：死苗接种后 不能在动物体内繁殖 ，因此使用接种 剂量较大 ， 免疫期较短 ，需加入适当的 佐剂 以增强免疫效果延长免疫期。n 优点：研制周期短、使用安全和易于保存。目前所使用的有 组织灭活苗、油佐剂灭活苗和氢氧化铝胶灭活苗 等。四、疫苗及疫苗制备技术n 佐剂 : 一种物质先于抗原或与抗原混合同时注入动物体内，能 非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答 ，发挥辅助作用，这类物质统称为佐剂或免疫佐剂。n 加入佐剂 减少抗原用量 和 接种次数 。四、疫苗及疫苗制备技术n 佐剂的类型n 不溶性铝盐类佐剂 应用很广泛，通常使用的主要有氢氧化铝胶、明矾、磷酸三钙等。n 油水乳剂佐剂 是用矿物油、乳化剂 (如 Span-80、Tween-80)及稳定剂 (硬脂酸铝 )，按一定比例混合作为油相，然后与抗原液混合制成各种类型的油水乳剂。n 蜂胶佐剂n 合成佐剂 胞壁酰二肽 (MDP)及其衍生物等。 四、疫苗及疫苗制备技术n （ 3）代谢产物和亚单位疫苗 n 代谢产物疫苗： 如 毒素、酶 等都可制成疫苗，破伤风毒素、白喉毒素、肉毒毒素、致病性大肠杆菌肠毒素，经甲醛灭活后制成的类毒素有好的免疫原性，可作为主动免疫制剂。n 亚单位疫苗： 是将病毒的 衣壳蛋白与核酸分开 、除去核酸用提纯的 蛋白质衣壳制成的疫苗 。此类苗保含有病毒的抗原成分，无核酸，因而无不良反应，使用安全，效果较好。猪口蹄疫、伪狂犬病、狂犬病等亚单位疫苗已有成功的试验报道。亚单位疫苗 由于制备困难，价格昂贵。四、疫苗及疫苗制备技术n （ 4）生物技术疫苗 n 利用生物技术制备的 分子水平的疫苗 ，包括基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗、抗独特型疫苗、基因工程活疫苗以及 DNA疫苗。n 基因工程亚单位疫苗 ：用 DNA重组技术，将 编码病原微生物保护性抗原的基因导人受体菌 (如大肠杆菌 )或细胞 ，使其在受体细胞中高效表达， 分泌保护性抗原肽链。 提取保护性抗原肽链，加入佐剂即制成基因工程亚单位疫苗。四、疫苗及疫苗制备技术n （ 4）生物技术疫苗 n DNA疫苗 : 是一种最新的分子水平的生物技术疫苗，将 编码保护性抗原的基因 与能 在真核细胞中表达的载体 DNA重组 ，重组的 DNA可直接注射 (接种 )到动物 (如小鼠 )体内， 目的基因可在动物体内表达 ，刺激机体产生体液免疫和细胞免疫。四、疫苗及疫苗制备技术n 2、病毒与细胞培养n 病毒的培养繁殖 只能在 活细胞内 进行，是以病毒基因为模板，在酶的作用下，分别合成其基因及蛋白质，再组装成完整的病毒颗粒，这种方式称为 复制。n 常见的病毒培养方法 有：细胞（包括组织器官）培养法；鸡胚培养法；实验动物培养法。 n SPF动物或 SPF鸡胚，仍常用于培养病毒，但病毒细胞培养 发展最快，重点介绍。四、疫苗及疫苗制备技术n 2.1、病毒细胞培养n 概念：将适宜组织中的细胞分散，在培养液中进行 细胞培养 ， 再接种病毒 ，让病毒在细胞中繁殖来培养病毒的方法。n 用途：用于病毒学研究，分离病毒，病毒克隆纯化，病毒病诊断及疫苗制备等。四、疫苗及疫苗制备技术n 细胞培养类型 ：原代培养、传代培养、细胞株n 细胞 培养的方法 ：最常用的方法为静置培养及旋转培养，还可用悬浮培养或微载体培养技术等。n 静置培养 ：将消化分散的细胞悬液分装于 培养瓶 (管 )或培养板 (孔 )，生成贴壁的单层细胞 。旋转培养：细胞可在培养瓶 (管 )的 四壁 长满单层，此法的产量高，适用于疫苗生产。微载体培养也用于规模化细胞或疫苗生产。四、疫苗及疫苗制备技术n 2.2 病毒与细胞相互作用的类型n 宿主细胞感染病毒发生的变化有 杀细胞 和 非杀细胞 两种。n 具体分为 细胞死亡 （杀细胞、细胞病变、细胞裂解），生产性 （细胞存活、允许病毒繁殖、分泌释放）， 非生产性 （细胞存活、阻断病毒复制）， 转化 （病毒基因与细胞基因整合、可致肿瘤、细胞形态变化）。四、疫苗及疫苗制备技术n 2.2 病毒与细胞相互作用的类型n 病毒引致的 杀细胞 变化：感染导致的细胞损伤称之为细胞病变 (CPE)。 CPE可在 光学显微镜 下观察，是病毒学检测及研究的常规手段之一。n 病毒产生 CPE的能力与其对动物的 致病力正相关 ，因此通常用 CPE作为指标，来判定病毒的 毒力 ，即计算病毒的半数细胞感染量 (TcID50)。四、疫苗及疫苗制备技术n 2.2 病毒与细胞相互作用的类型n 空斑或蚀斑：将 10倍梯度稀释的病毒样本接种吸附于单层细胞，而后在细胞上覆盖一层含营养液的琼脂，以防止游离的病毒通过营养液扩散，但病毒可在细胞间传递。经过一段时间培养，进行染色，原先感染病毒的细胞及病毒扩散的周围细胞会形成一个近似圆形的斑点，类似固体培养基上的菌落形态。四、疫苗及疫苗制备技术n 2.2 病毒与细胞相互作用的类型n 将获得的单个空斑制作悬液，梯度稀释后再作空斑，最终可获得只含一个病毒颗粒及其子代的空斑，这就是病毒克隆。借助空斑技术不仅可纯化病毒，还对病毒定量，定量单位称为空斑形成单位 (PFU)。n 通过 PFU的计数及 PFU减数试验，可滴定血清的效价、测定干扰素的活性等。许多动物病毒如疱疹病毒、披膜病、微RNA病毒及水泡性口炎病毒均可通过此法作定量分析。四、疫苗及疫苗制备技术n 2.2 病毒与细胞相互作用的类型n 病毒引致的 非杀细胞变化 ：非杀细胞病毒的感染 通常引致持续感染 ，对细胞的新陈代谢并无大碍，但同时还生产并释放子代病毒颗粒。除少数例外， 大多持续感染的细胞 发生慢性渐进性变化， 最终死亡 。四、疫苗及疫苗制备技术n 3、疫苗制备工艺流程n 例：流行性乙型脑炎病毒死疫苗制备工艺n 地 鼠 肾剪碎，胰酶消化n 地鼠肾细胞悬液n 37 ,3天 细胞培养液， pH7.0 pH7.2n 单层细胞n 洗涤细胞，去除牛血清n 10-4 10-5浓度病毒感染细胞n 32 34 培养 2 3天n 收获病毒液（收二次）n 按 1:2000加入甲醛， 22 ， 8天灭活病毒液n 合并，安全及效力试验（原液 ）n 加入亚硫酸氨钠（半成品）n 分装（成品）检定 (包括理化性质，无菌试验、安全试验，防腐剂、残余牛血清含量等）n 合格成品细胞培养病毒感染病毒灭活四、疫苗及疫苗制备技术n 病毒灭活 ：病毒受理化因素作用后，失去感染性。