第六章 兽医生物制品制造基本程序

第六章 兽医生物制品制造基本程序第一节 疫苗制造流程第二节 免疫血清制造流程第三节 诊断制剂制造流程第二节 免疫血清制造流程一、动物的选择与管理二、免疫原三、免疫程序四、血液的采集与血清提取五、几种重要畜禽用免疫血清、卵黄抗体的制备方法六、免疫血清及卵黄抗体使用注意事项1、免疫血清的概念n又称 高免血清、抗血清、免疫血清、被动免疫制品 。n利用病原微生物或其代谢产物等作为 免疫原 ，经过反复 多次注射 同一 动物 体，促使动物不断产生免疫应答，在 血清 中含有大量对应的特异性抗体而制成。n分类（据免疫血清作用的对象不同）： 抗病血清 和 抗毒素 。2、作用机理n含有特异性的免疫球蛋白 抗体 输入动物体后，动物即可被动地获得抗体，从而形成免疫力，即所谓的 人工被动免疫 。当动物已感染某种病原微生物发生传染病时，注射大量抗病血清后，由于抗体的作用，可 抑制动物体内的病原体继续繁殖 ，并 协助体内正常防御机能，消灭病原微生物 ，使病畜逐渐恢复健康。n特点：具有很强的特异性，一种血清只对相应的一种病原微生物或毒素起作用。3、应用n用作紧急预防注射，通常是 在已经发生传染病或受到传染病威胁的情况下使用 。n优点：产生免疫力快，n缺点：持续期短（一般仅 23周）。n目前生产较多的抗病血清有： 破伤风抗毒素 、4、免疫血清制造流程n动物的选择与管理 免疫原的制备 免疫程序 血液采集与血清提取一、动物的选择与管理（一）动物的选择1、动物的品种n用于制备免疫血清的动物有马、牛、山羊、绵羊、猪、兔、犬、鸡和鹅等。用同种动物产生的称 同源血清 ，用异种动物生产的称 异源血清 。（ 1） 制备抗菌和抗毒素血清多用异种动物 ，通常用马和牛等大动物制备。如破伤风抗毒素多用青年马制备，抗猪丹毒血清多用牛制备。抗病毒血清的制备多用同种动物 。如犬瘟热血清用犬制备，抗猪瘟血清用猪制备。（ 2） 制备免疫血清用马较多 ，也可使用 多种动物（如马、牛、羊三种动物） 制备一种抗毒素血清。（ 3）选定动物应 有一定的数量 ，一个批次应用多头动物。2、动物的年龄及健康情况（ 1）通常选择 体型较大、性情温驯、体制强健的青壮年动物 为宜。n马以年龄 38岁、体重 350kg以上者为宜；牛以310岁、体重 300400kg以上为宜；猪以 50kg以上，年龄 612月龄为宜；家兔体重需达 2kg以上为好。（ 2）供制造免疫血清的动物，必须从 非疫区 选购，经过严格检疫，并经隔离观察，每日测温两次，观察 2周以上，确认 健康 者方可应用。（二）动物的管理1、动物应在 隔离 条件下 饲养 ，杜绝高免时强毒及发病时 散毒 。2、应 详细登记 每头动物的来源、品种、性别、年龄、体重、特征及营养状况、体温记录和检疫结果等， 建立制造血清动物的档案 ，只有符合要求的动物才能投入生产。3、 加强日常饲养管理 ，给适量的食盐和含钙的补充饲料。4、在高度免疫和采血期间，每日要检测体温两次，随时 观察其健康情况 。 每日至少运动 4h。动物 采血前 1d禁食喂水 ，避免血中出现乳糜。5、在生产过程中，若发现健康状况异常或有患病可疑时，应停止注射抗原和采血，并进行隔离治疗。二、免疫原（一）免疫原的基本要求n一般来说， 颗粒性抗原 较可溶性抗原的抗原性强，聚合状态的蛋白质较单体状态的蛋白质免疫原性强。相对分子质量较小和抗原性较低的蛋白质应吸附于载体上，才可获得较高的免疫原性。n异物性、结构的复杂性、分子量大、一定的物理性状。（二）免疫原的制备1、抗细菌免疫血清制备n基础免疫 用抗原多为 疫苗 或 死菌 ，而 高度免疫 的抗原，一般选用 毒力较强的毒株 。 多价抗病血清用的抗原 ，要求用 多血清型 菌株 。细菌抗原：培养 洗菌苔 离心 计数 稀释为含菌 100亿 /毫升 灭活（水浴 802h 或加 0.4%甲醛372448h ）。2、抗病毒免疫血清制备n以病毒为免疫原，须通过 反复冻融或超声裂解 方法，将病毒从细胞中释放出来，并尽可能地提高病毒滴度和免疫原性。n如抗猪瘟血清，基础免疫的抗原，可用猪瘟兔化 弱毒 疫苗；高度免疫抗原，则用猪瘟血毒或脏淋毒乳剂等 强毒 。病毒抗原： 离心： 8000转 /min20min 取上清液 超速离心 2万转/min2h 病毒沉淀下来。 聚乙二醇吸附：聚乙二醇 +NDV尿囊液 NDV 。 透析袋：将病毒培养液放入透析袋中，用蔗糖吸收水分。3、抗毒素血清制备n免疫原可用 类毒素、毒素或全培养物（活菌加毒素 ） ，但后两者只有在需要加强免疫刺激的情况下才应用，一般多用类毒素作免疫原。三、免疫程序基础免疫高度免疫（加强免疫）免疫途径： 皮下或肌肉注射，如剂量较大时，采用多部位注射法。v 1、基础免疫：注射死苗或弱毒苗，一般 23次，间隔时间 12周，剂量逐渐加大。v 首免 1头份 12周后二免 5头份 12周后三免 20头份。n可为高度免疫产生有效的回忆应答打下基础。v 2、加强免疫：（高度免疫）：攻强毒（攻多次，一般 35次），间隔 1周。v 基础免疫后 2周第一次加强免疫 1周后第二次加强免疫 1周后第三次加强免疫 抗体水平升高 测抗体效价 符合要求 采血 制备血清。v （高免的 注射次数要视血清抗体效价而定 。有的只要大量注射 12次强毒抗原，即可完成高度免疫；有的则要注射 10次以上，才能产生高效价的免疫血清。 ）初次及再次免疫应答抗体产生的一般规律（三）制定原则1、免疫原注射途径一般采用 皮下或肌肉注射 。如果免疫剂量大，应采用 多部位注射法 ，尤其在应用佐剂抗原时更应注意此点。2、免疫程序对制备高免血清非常重要， 掌握抗体消长规律 ，适时免疫和采血尤为重要。不能机械地定期免疫和采血。3、如有的动物在长期免疫和采血过程中，可能在抗体达到一定水平后，反而逐渐降低，对免疫原的刺激无应答反应，这可能 与免疫剂量、免疫间隔时间和免疫原中混杂免疫抑制物有关 。此时，应给免疫动物足够时间休息，解除免疫抑制作用，并调整免疫程序。四、血液采集与血清提取（一）采血次数和方法1、采血时间n一般血清抗体的效价高峰在 最后一次免疫后的710d。n按照免疫程序完成免疫的动物，经采血检验（试血）， 血清效价达到合格标准时，即可采血 。不合格者，再度免疫，多次免疫仍不合格者淘汰。2、采血次数n采血可以全放血或部分采血，即 一次采集或多次采集，采血时应尽可能地作到 无菌操作 。3、采血方法n放血前，动物应禁食 24h，但需饮水以防止血脂过高。n多次采血者 ，按体重每千克采血约 10ml，经 35d第二次采血，按体重每千克采 810ml。第二次采血后经 23d，注射足量免疫原。如此循环免疫和采血 。n全放血者 ， 在最后一次高免之后的 811d进行放血。4、采血部位n豚鼠由 心脏 穿刺采血；家兔可以从 心脏采血或颈静脉、颈动脉 放血，少量采血可通过 耳静脉采取；马由 颈动脉或颈静脉 放血；羊可从 颈静脉采血 或 颈动脉、颈静脉 放血；家禽可以 心脏穿刺采血或 颈动脉 放血。（二）血清的分离n采血时一般 不加抗凝剂 ，全血在室温中 自然凝固 ，在灭菌容器中使之与空气有较大的接触面。待血液凝固后进行剥离或者将凝血切成若干小块，并使其与容器剥离。先置于 37 12h，然后置于 4 冰箱过夜，次日离心收集血清。n如果采集的血量较大时，可采用 自然凝固加压法 。即将动物血直接集于事先用灭菌生理盐水或 PBS液湿润的玻璃筒内，置室温自然凝约 24h，有血清析出时，每采血筒中加入灭菌的不锈钢压铊，经 24h后，用虹吸法将血清吸入灭菌瓶中。n提取的血清放入灭菌瓶中，加入 0.5%石炭酸或0.02%硫柳汞防腐。放置数日作无菌检验。无菌的血清，组批分装，保存于 15 半成品库，待抽检合格后交成品库保存出厂。基础免疫 用抗原多为 疫苗 或死菌 ，而 高度免疫 的抗原，一般选用 毒力较强的毒株 。五、几种重要畜禽用免疫血清、卵黄抗体的制备方法（一）猪瘟抗血清1、动物的选择n选用 60kg左右 ， 健康、营养良好 的 猪 ；2、免疫原n基础免疫： 猪瘟兔化弱毒疫苗n高度免疫： 血毒抗病毒血清的制备多用同种动物 ； 通常选择 体型较大、 体质 强健的青壮年动物 。3、免疫程序（ 1）基础免疫n注射猪瘟兔化 弱毒疫苗 2ml（ 2）高度免疫基础免疫后隔 14 21d后，用强毒进行高度免疫，n第一次高免， 肌肉注射 血毒 100ml；n第二次，肌肉注射血毒 200ml；n第三次，肌肉注射血毒 300ml；每次间隔 10d。4、血液采集n第三次高免后 9 11d放血，也可以多次采血。基础免疫 抗原无须过多过强免疫原注射途径一般采用 皮下或肌肉注射免疫剂量 逐渐增加（二）破伤风抗毒素1、动物的选择n选择 5 12岁营养良好的马匹；2、免疫原n基础免疫：破伤风类毒素n高度免疫：血毒3、免疫程序（ 1）基础免疫n第一次，注射精制破伤风类毒素油佐剂抗原