现代微生物遗传学---第四授课单元-课件

第四授课单元第三章 质粒第一节 质粒的发现和命名 质粒： 存在于细菌、真菌等微生物细胞中、独立于染色体外、能进行自我复制的遗传因子。 对于宿主，一般是非必需的 通常是共价 (covalent)、闭合 (closed)、环状 (circular)双链 DNA.(但也有例外：线状 DNA， RNA) 附加体：整合在染色体上，或游离，并能携带宿主的染色体基因。 一、质粒的发现 F质粒 (1946年 )，第一个被发现的质粒 20世纪 50-70年代：抗性质粒的大量研究，以及其他质粒的发现 20世纪 70年代后，质粒广泛应用于遗传工程和分子生物学研究中。 二、质粒的命名原则 最初发现的质粒由研究者根据表型、大小等特征自行命名。 (F因子、 R质粒、 Col质粒等 ) 1976年 Novick提出了质粒命名原则： 质粒名称一般由三个英文字母及编号组成； 第一个字母一律小写 p表示（ plasmid） 后两个字母要大写，可以采用发现者人名、实验室名称、表型性状或其他特征的英文缩写。 编号为阿拉伯数字，用于区分同一类型的不同质粒。 (pUC18, pUC19等 )第二节 质粒编码的遗传表型 大多数质粒均控制着宿主细胞的一种或几种特殊性状，具有一定的表型，质粒可依据其表型不同可划分为以下几类： 1.致育质粒 2.抗药性质粒 组成：转移区和抗性决定子 抗药的机制：改变抗生素作用的靶点；修饰抗生素；组织抗生素进入；产生一种酶能代替宿主细胞中被抗生素作用的靶点。 3.产生抗生素的质粒 细菌素：细菌产生的一般只能抑制或杀死种内不同亚种或菌株中敏感细菌的特殊 多肽类 代谢产物。 Col质粒： 10种，有非接合型和接合型之分。 4.产生毒性的质粒 (BT) 5.降解质粒： 假单胞菌属 是一类能广泛利用有机化合物进行生长的细菌。其体内含有大量的降解质粒。 6.致病性质粒： 根癌土壤农杆菌的 Ti质粒；以及破伤风梭菌、肉毒梭菌和大肠杆菌等都存在致病性质粒。 7. 共生固氮质粒 根瘤菌普遍喊有该类质粒。 包括共生质粒和非共生质粒，非共生质粒对共生作用可有正或负的调节作用。 8. 隐蔽质粒 (cryptic plasmid) 酵母的 2m质粒 （ p171） 长为 2m的 6kb的环状双链 DNA分子 位于酵母细胞核内， 50100拷贝 只携带与复制和重组有关的 4 个基因，无遗传表型 质粒上有两个 600bp长的 IR，被一个 2.7kb区域和一个 2.3kb小区域所间隔 两个 IR上都有一个专一重组位点 (FRT)，经过重组，可使质粒互变异构成 A型和 B型。第三节 质粒的检测 检测质粒的方法主要根据质粒的（遗传学特性）和（分子结构特性）。 遗传特性：独特的表型、转移、人为消除等。 分子结构： cccDNA和染色体相比对理化因子有更强的抗性。 一、质粒消除（理化因子和生物学方法） 理化因子消除法 消除剂：吖啶类， EB，某些抗生素，高温， UV等 如何判断某一遗传性状的丧失是质粒消除的结果还是染色体基因突变的结果呢？ 回复突变情况 突变率 理化因子消除质粒的作用机制： 对质粒本身的复制和分离产生抑制作用，在生长中被淘汰 选择性抑制带有质粒的菌的生长。 2.原生质体消除法 使待消除质粒的菌株在一定条件下形成原生质体，在再生后生长的菌株中可出现高频率质粒消除菌。 二、遗传转移 将质粒导入已经消除了该质粒的原宿主细胞，比较导入前后表型性状的差异或恢复程度。 三、分子杂交 在初步确定某菌株可能含有质粒的情况下，利用已知表型性状的基因片段作探针进行分子杂交，来检测其菌株是否含有该种质粒。 四、质粒的分离、检测与纯化 质粒分离方法：碱变性法 菌体的培养和收集 溶菌 碱变性处理 离心分离 有时为了快速提取质粒 DNA，可以在提取液碱变性后，用 pH4.8的醋酸钠高盐缓冲液调节 pH到中性，这时染色体 DNA不能复性而形成缠连的网状结构，而即使变性的质粒可以恢复到原来的构型，再通过离心，这样可以缩短提取质粒的时间。 纯化和检测方法 琼脂糖凝胶电泳 (质粒 3种构型泳动速度不同，琼脂糖浓度， EB染色，分子量的判断 ) 氯化铯 -EB密度梯度离心 电镜观察第四节 质粒的复制与调节 一、质粒的大小和拷贝数 1.大小测定 表示方式： MD或 kb， 1MD的双链 DNA1.65kb。 测定方法：电泳、电镜、测序。 大小范围： 1200kb，个别 8001000。 2.质粒的拷贝数 严紧型质粒 (stringent plasmid)或低拷贝质粒； 松弛型质粒 (relaxed plasmid)或高拷贝质粒。（氯霉素可抑制细胞分离，终止染色体复制，但松弛型质粒可持续复制，其拷贝数可达到 10003000）。 二、质粒的复制 1.质粒复制的方式(P120) 质粒的复制起点称为 oriV,大肠杆菌为oriC。 复制主要通过 型复制和滚环复制之一进行。其中以 型复制为主（包括单向和双向）。 质粒只编码一种或少数几种与复制有关的蛋白质，其他复制蛋白都来自宿主。 2.复制起点区 oriV的功能和 pBR322质粒 复制起点区 oriV功能与质粒载体的构建、寄主范围 pBR322质粒： pMB1的 ori和 rop（ ROP蛋白对质粒的复制负调控）区； pSC101的 tetr； Tn3的 ampr。属中等拷贝质粒， 1030个 /细胞 pUC类：高拷贝质粒（ 100300个 /细胞），也是 pMB1的 ori，但是没有 rop。 质粒的寄主范围和质粒的拷贝数均决定于质粒的 ori区域。三、质粒复制的调控 质粒的调控一般采用直接或间接的 负调控 机制。 负调控因子可是 蛋白质 、 RNA或 DNA重复序列。 调控类型可分两类： 抑制物 -靶位调控 (inhibitor-target regulation) 重复子 -竞争结合调控 (iteron-binding regulation) 1.抑制物 -靶位调控 依赖一小段 反向转录的RNA作为抑制物，通过它与 质粒 DNA复制引物 或 编码 Rep蛋白（复制蛋白）的 mRNA的互补结合以阻止质粒复制的起始。 (1) ColE1质粒复制调控（ P122图 5-7） 抑制物（负调控因子）：反义RNA、 Rop蛋白 靶位：质粒复制的前提引物 机制：反义 RNA和引物 RNA互补结合，阻止其发挥作用； Rop 蛋白具有强化反义RNA和引物 RNA结合的作用。 是抑制物对靶位的直接调控模型。 (2)R1质粒的复制调控 抑制物通过抑制 Rep蛋白的形成而阻止了该蛋白对 oriV的激活作用。是间接调控模型。 抑制物： CopB蛋白：是PrepA启动子的阻遏蛋白； copA基因转录产物 RNA： Rep蛋白 mRNA互补，抑制其合成 靶位： Rep蛋白的合成 2.重复子 -竞争结合调控 采用该机制进行调控的质粒为重复子质粒。 在复制起始位点 ori和复制基因 rep附近存在着多个长度为 1722bp的 DNA短片段。这些短片段叫 重复子。 重复子能与复制必需的 Rep蛋白竞争性结合，从而抑制了质粒的复制和拷贝数的增加。 pSC101、 F、 P1等都属于重复子质粒。 重复子质粒复制调控机制（两种 ,p124-125） (1)转录自体调控 ： RepA蛋白通过与自身启动子区的某些序列（如 pSC101中的反向重复序列 IR1和 IR2）的结合而抑制自身的合成，这种方式叫做转录自体调控。 (2)偶联模型调控 ：由于重复子序列间的相互作用使两个质粒偶联在一起，从而抑制了质粒复制的起始，该方式即为偶联模型。 质粒浓度低时， RepA蛋白只与一个质粒结合； 质粒浓度高时， RepA蛋白通过与重复子序列的结合使两个质粒联结在一起，阻止质粒的复制。 F质粒的复制调控 F质粒的复制区也含有 1922bp的重复序列， repE基因编码的 RepE蛋白也是质粒复制所必需的。 RepE蛋白是一种自体调控蛋白，可能也是通过与自身启动子结合对自身浓度进行调控。 RepE蛋白通过与重复子序列结合抑制质粒复制。四、质粒之间的不相容性 不相容性 (incompatibility): 亲缘关系相近的两种质粒，在非选择性条件下不能稳定存在于同一个细胞中，该种特性为质粒的不相容性。与质粒的复制起始的控制密切相关。 同种质粒的衍生物总是不相容的； 不同质粒的衍生物可能相容，也可能不相容。 不相容群 (incompatibility group)：不能在同一个细胞中同时稳定存在的质粒属于一个不相容群。因此，不同的不相容群的质粒能同时稳定存在于一个细胞中。五、质粒的稳定性 质粒的不稳定性包括： 分离的不稳定性 和 结构的不稳定性 。 质粒分配到子细胞中的途径包括： 主动分配 (active distribution)和 随机分配 (random distribution)两种方式。 1.主动分配机理 该类质粒一般为低拷贝质粒。其稳定性通过质粒编码的基因产物来实现，包括编码主动分配体系的 par区和致死基因。 par区：即分配区 partition region，指在细胞分裂过程中使质粒拷贝数均等分配到子细胞中的质粒 DNA序列。 质粒的复制与分配是分开独立进行的。 F质粒的 par区结构和分配机理 结构（ p128图 5-13）：反式作用基因 (sopA, sopB)，顺式作用位点 (sopC)。 机理： sopC区的功能类似于真核染色体上的着丝粒，所以又称为类着丝粒位点 (centromete-like site)。反式作用蛋白 SopB与顺式作用位点 sopC区结合形成成为分配复合体 的蛋白 -核酸复合物。该复合物参与质粒的分配。如缺失 sopABC片段，质粒进行随机分配。 SopA蛋白的功能： SopA蛋白和 SopB蛋白属自体阻遏蛋白。 SopB促进 SopA和其自身启动子结合，抑制转录。控制 SopB蛋白浓度。 寄主致死体系 (host-killing mechanism) 通过杀死细胞分裂后出现的无质粒子细胞的方