第5章分子发光分析法

第 5章 分子发光分析法一、分子荧光与磷光产生过程luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence二、激发光谱与荧光光谱excitation spectrum and fluore-scence spectrum三、荧光的产生与分子结构关系 relation between fluorescence and molecular structure四、影响荧光强度的因素factor influenced fluorescence五、荧光 (磷光 )光谱仪fluorescence / phosphorescence spectrophotometer *第一节 分子荧光与磷光molecular luminescenceanalysis molecular fluorescence and phosphorescence一、荧光与磷光的产生过程luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence*从分子结构理论，讨论荧光及磷光的产生机理。1. 分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态 (S0) 激发态 (S1、 S2、 激发态振动能级 )： 吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态 基态：多种途径和方式 (见能级图 )；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、 电子激发单重态 S1 、 S2 ；第一、第二、 电子激发三重态 T1 、 T2 ；*S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换 振动弛豫能量 2 1 3外转换 2T2内转换振动弛豫2.电子激发态的多重度*电子激发态的多重度： M=2S+1S为电子自旋量子数的代数和 (0或 1)；平行自旋比成对自旋稳定 (洪特规则 )，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态（ Pauli不相容原理）； S0 S1、 S2允许跃迁；S0 T1 禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图 )；进入的几率小； 3.激发态 基态的能量传递途径*电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁 (发光 )和非辐射跃迁等方式失去能量（ 去活化 ）；去活化辐射跃迁荧光 磷光 内转移 外转移系间跨越 振动弛豫非辐射跃迁激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光 ： 10-7 10 -9 s,第一激发 单重态 的最低振动能级 基态；磷光 ： 10-4 10s； 第一激发 三重态 的最低振动能级 基态；（ 1）非辐射能量传递过程（非辐射跃迁）*振动弛豫 ： 同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间 10 -12 s。内转换 ：相同多重度等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。外转换 ：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或 “ 猝灭 ” 。系间跨越 ：不同多重态 ,有重叠的振动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁。但若重叠程度较大时，可通过自旋 轨道耦合等作用完成系间跨越。（ 2）辐射能量传递过程（辐射跃迁）*荧光发射 ： 电子由第一激发单重态的最低振动能级 基态（ 多为 S1 S0跃迁 ）， 发射波长为 2的荧光； 10-7 10 -9 s 。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； 2 2 1 ；磷光发射 ：电子由第一激发三重态的最低振动能级 基态（ T1 S0跃迁 ）；电子由 S0进入 T1的可能过程：（ S0 T1禁阻跃迁）S0 激发 振动弛豫 内转换 系间跨越 振动弛豫 T1发光速度很慢发光速度很慢 ： 10-4 10 s 。 光照停止后，可持续一段时间光照停止后，可持续一段时间 。（ 3） 荧光与磷光的根本区别：荧光 是由 激发 单单 重态 最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的；磷光 是由 激发 三三 重态 的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。*二、激发光谱与荧 (磷 )光光谱（发射光谱）excitation spectrum and fluore-scence spectrum*荧光 (磷光 )：光致发光，激发光波长怎样选择？1.荧光 (磷光 )的激发光谱曲线选 最大发射波长 为测量波长，改变激发光的波长，测量荧光(磷光 )强度的变化。化合物发射的荧光 (磷光 )强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线 I ） 。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；2.荧光光谱 (或磷光光谱 )*将激发光波长固定在 最大激发波长处 ,然后扫描发射波长，测定不同发射波长处的荧光 (或磷光）强度 (图中曲线 II或 III)。*3.激发光谱与发射光谱的关系*a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值 。 发射光谱的波长比激发光谱的长， 振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量 (如能级图 2 , 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。 c. 镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 *200 250 300 350 400 450 500荧光激发光谱 荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱三、荧光的产生与分子结构的关系（实际上只有很少的有机分子能发射荧光）*1.分子产生荧光必须具备的条件（ 1）具有合适的结构（与激发光频率相适应），才能吸收；（ 2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（ ）：荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关若用数学式来表达这些关系，得到= kf /（ kf+ki）式中 kf为 荧光发射 过程的 速率常数 ， ki为 其它有关过程的速率常数的总和 。凡是能使 kf 值升高而使其它 ki值降低的因素，都可增强荧光。实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，其量子产率在某些情况下接近 1，说明 ki很小，可以忽略不计。一般来说， kf主要取决于化学结构，而 ki则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。什么样的结构会产生荧光？它们之间的关系如何？*2.化合物的结构与荧光*（ 1）跃迁类型： * 跃迁 的荧光效率较高， 这是由于 跃迁比n具有更大的摩尔吸光系数，且 * 比 n跃迁的寿命更短 ，有利于荧光的产生；（ 2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（ 3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（ 4）取代基效应 ： 芳环上供电子基团增强荧光（如 -OH， -OR， NH2， CN， NR2等）。吸电子基团（ COOH、 C O、 NO2、 卤素等）则减弱荧光*内部重原子效应、外部重原子效应四、影响荧光强度的因素relation between fluorescence and molecular structure*影响荧光强度的 外部因素1.溶剂的影响除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；2.温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加，荧光强度下降。3. 溶液 pH对酸碱化合物，溶液 pH的影响较大，需要严格控制；4.内滤光作用和自吸现象*自吸现象 ：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用 ：溶液中含有能吸收激发光或荧光的物质。如色胺酸中的重铬酸钾；5.溶液荧光的猝灭（ P95）*荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。导致荧光猝灭的主要类型： 碰撞猝灭 （主要类型之一）碰撞猝灭是指处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方式回到基态，产生猝灭作用。 静态猝灭 （组成化合物的猝灭）由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收光谱的改变。 转入三重态的猝灭分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重态。转入三重态的分子不发射荧光而使荧光猝灭。溶液中的溶解氧可对有机化合物的荧光产生猝灭效应。* 发生电荷转移反应的猝灭某些猝灭剂分子（如 Fe2 ）与荧光物质分子（如甲基蓝）发生了电荷转移反应，使其荧光猝灭。 荧光物质的自猝灭在浓度较高的荧光物质溶液中， 单重激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光物质分子碰撞而引起的自猝灭。 有些荧光物质分子在溶液浓度较高时会形成二聚体或多聚体，使它们的吸收光谱发生变化，也引起溶液荧光强度的降低或消失。*五、荧光光谱仪*测量荧光的仪器主要由 四个部分 组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点 ： 有两个单色器；检测器与激发光方向成直角。基本流程如图：单色器 ： 选择激发光波长的第一单色器和选择发射光 (测量 )波长的第二单色器；光源 ： 氙灯和高压汞灯，染料激光器 (可见紫外区 )检测器 ： 光电倍增管等。仪器光路图*磷光检测（磷光光谱仪）*荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。可在有荧光发射的同时测量磷光。测量方法：（ 1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。（ 2）采用脉冲光源 (即时间分辨技术 )。室温测量时，不需要杜瓦瓶。六、分子荧光分析法及其应用*1. 特点（ 1）灵敏度高比紫外 -可见分光光度法高 2 4个数量级，检测下限：0.1 0.001g/ml （ 2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱来鉴定物质；（ 3）试样量少、方法简便（ 4）提供较多的物理参数缺点 ：应用范围小。2.定量依据与方法*(1)定量依据荧光强度 If正比于 吸收的光 强 Ia和荧光量子效率 ：If = Ia由朗伯 -比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后：If = 2.3 I0 l c = Kc即荧光强度与荧光物质的浓度成正比，但这种线性关系只有在极稀的溶液中（ A lc0.05）才成立 。对于较浓溶液，由于猝灭和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。（ 2）定量方法*标准曲线法：配制一系列标准溶液测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知样的荧光