细胞培养技术的应用及前景讲述

播报人：周亮制作人：刘国兴材料收集：鲍岛 费景龙概述 细胞生物学、分子生物学以及免疫学是现代三大前沿生物科学，发展异常迅速。细胞培养是细胞生物学研究中最常用的方法之一。由于在体外培养中和机体内，细胞行为的基本规律是一样的，因此许多研究可以在体外进行。更重要的是，在培养条件下，人们可以有目的的、有选择地控制细胞生长的环境，因此可以研究在某些特殊条件下的细胞生物学行为。本讲主要目的是介绍动物细胞培养技术及其应用。一 分类1.组织培养 (Tissue Culture)指的是从体内取出组织摹拟体内生理环境 ,在无菌 、适当温度和一定营养条件下 ,使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。2.细胞培养 (Cell Culture):培养物是单个细胞和细胞群。3.器官培养 （ Organ Culture） ： 培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官 ,使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法 .历史1885年 Roux最早尝试使组织离体培养 ,材料是鸡胚神经板 ,采用生理盐水为培养液 ,并首次采用组织培养这个术语。 1907年 Harrison 和 1912年 Carrel开始把组织培养作为一种方法 ,用于研究离体动物细胞的培养。l 体外培养技术的发展大致可分三个时期： 50年代之前是细胞培养在多个领域发展期；l 50年代是细胞培养迅猛发展期，多种培养技术相继建立；l 50年代后是体外培养技术与生命科学其他技术结合发展的新时期，诞生了多种培养的应用技术 。由于组织培养在医学研究中的应用，如抗病毒疫苗的生产等，现已经逐渐发展成为一门精细技术。许多细胞株、细胞系的培育成功，尤其是以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如 Hela细胞系（Gey， 1952），可用来进行一系列研究，更加促进了组织培养技术的发展。1)细胞内部的种种活动 ,如 DNA的复制和转录、蛋白质合成、能量代谢 ;2)细胞内部的流动 ,如 RNA从细胞核向细胞质方向运转 ,激素受体复合物的易位等 ;3)生态学 ,如营养、感染、病毒或化学诱变、药物作用 ;4)细胞与细胞之间的相互作用 ,如胚胎诱导、细胞群体的动力学等 .1）理化环境可以调控2）细胞经过多次传代培养形成 细胞系 ，其特征基本相同，对外界影响因素的反应也较为一致。3）培养物可直接暴露在预测的试剂中，预测样品用量少，并可直接观测反应。4）可通过繁殖扩增，提供大量均匀的细胞备用，供比较不同因素或同一因素不同剂量对同一细胞株的作用。5）可以人工筛选具有一定特征变异的细胞株或细胞融合，有利于基因功能的研究。6）组织培养结合缩时电影技术，可以直接观察细胞的活动和对外界作用的反应。体内外细胞的差异 当人工条件和体内实际情况不完全相同时 ,细胞在体外培养后 ,一旦失去神经体液调节和细胞间相互影响 ,生活在缺乏动态平衡的环境中 ,发生变化则是必然 .细胞最多见的表现是 :返祖（ Atavism） 现象 失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、细胞趋单一化、不死性、恶性状。培养细胞的分化 不适应（ Deadaption） 细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显。例如肝细胞在体外丧失了产生酪氨酸转移酶的特性 .脱分化和去分化（ Dedifferentiation） 由于基因变异而使细胞失去分化能力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基酸转移酶的特性后 ,储存肝糖元的能力丧失 ,并很难再现 .所以说 ,不适应和脱分化两个概念不同 .不适应是因为生存条件改变而使分化发生抑制 ;从分子水平考虑 ,脱分化很可能是基因变异所致 . 培养细胞的形态 1.贴附型： 1）成纤维细胞：心肌细胞，血管内皮细胞等2）上皮型细胞：消化管外皮细胞，肝脏上皮细胞等3）游走型细胞：神经胶质细胞4）多形型细胞：神经组织细胞 2.悬浮型 ： 如癌细胞和血液白细胞 组织培养细胞的生长和增殖 1.原代培养（ Primary Culture） 阶段 ： 原代培养也称初代培养，严格的说即从体内取出 组织 接种培养到第一次 传代 阶段，但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养 ，随不同的组织时间长短不一，一般为 1-4w。2.传代培养（ Subculture） 阶段 ： 或称继代培养。也就是 细胞系 （ Cell line） 阶段。细胞增殖旺盛，一般细胞可传代 10-50代）。二倍体细胞系 （ Diploid cell line）： 即细胞保持二倍体核型。 3.衰退阶段 ：细胞增殖减慢或不增殖，甚至最后凋亡。但少数情况下，在这三期的任何一点，由于某种因素影响，细胞发生自发性转化。（物理 化学 病毒等因素 1） 潜伏期（ Latent phase） ： 细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。 2倍体细胞该期时间长（24-96h）， 连续细胞系时间短（ 10-30min）。2) 指数生长期 （ Logarthmic growth phase）： 细胞增殖最旺盛时期，一般用 细胞分裂指数 （ Mitotic index MI） 表示：即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数介于 0.1-0.5% ，且受细胞种类培养液成分、 pH、 温度等影响。指数生长期是细胞活力最好的时期，在接种细胞数量适宜情况下，指数生长期持续 3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现 接触抑制 （ Contact inhibition） 。 而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一。但癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生 密度抑制 （ Density inhibition）。3）停滞期（ Stagnate phase）： 即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少 ,代谢产物积累 ,PH下降细胞停止增殖，进入停滞期。在此时应及时进行换液传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再传1-2代后，细胞才能恢复。 细胞培养中应注意的几个问题 1）培养液和培养物 :一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长 ,不能盲目增加每单位体积的细胞浓度 . 2） PH:7.2-7.4 7.6或 6.0 细胞损伤、退变或死亡3） 培养瓶内的空间 :一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为 1:10.4）容积、深度、表面面积 :培养液体积与表面面积的比例为 0.2-0.5ml/cm.5）去除死细胞 : 6) 温度控制：动物细胞培养对温度波动较为敏感。温度低于 36.5C， 细胞生长缓慢，高于 38C， 细胞失去活力。1.据 CCTV4报道， 13年 10月中国台湾地区台北荣民总医院在干细胞研究方面有重大突破，研究人员利用干细胞已分化出网膜和心肌细胞，目前该研究正处于临床实验阶段，未来有望生产干细胞药品有效治疗失明、心脏病等。 l2.一口好牙不但能给出一个美丽的笑容，还是健康的标志。但由于疾病或意外事故，我们可能失去牙齿。镶颗金牙吧，有损整体美观。现在好了，科学家成功利用人的尿液衍生的细胞诱导形成干细胞获得再生牙齿雏形。 7月 30日，这项研究成果刊登在学术期刊 细胞再生 上，同时也引发国际社会广泛讨论。 l 3. 中化新网讯 科学家 13年 8月表示，他们已利用干细胞，培养出能在培养皿上自发收缩的人类心脏组织，意味在寻求制造移植器官方面获致进展。l美国宾州匹兹堡大学研究团队利用取自人类皮肤细胞得出的诱导性多功能干细胞（ iPS），制作出名为 MCPs的心脏前驱细胞。l 4. 2013年 7月，利用诱导性多功能干细胞（ iPSCs），日本科学家首次成功培育出具有功能的人类肝脏。 这项发表在 自然 上的研究结果轰动了整个科学界 。当前急需器官移植的患者众多，器官的捐献率却常年处于低位。iPS细胞培养的器官有望成为移植脏器的新来源，减少患者对于捐赠器官的依赖。研究小组利用人类诱导性多功能干细胞（iPSCs），在体外培育出简单的人类肝脏，移植到小鼠体内后，这些肝脏成功血管化并正常行使功能。这是科学界首次用诱导性多功能干细胞（ iPSCs）培育出具有功能的人类器官。 l 5. CLS生物治疗的原理是利用自身免疫杀灭肿瘤细胞。 2011年诺贝尔医学奖获得者斯坦曼博士在 1973年发现了激活免疫系统的关键细胞 DC细胞。在 20世纪 80年代，科学家又培养出了具有肿瘤强杀伤效应的 CIK细胞。这两种细胞是肿瘤生物治疗的关键。 CLS生物治疗通过体外实验万倍扩增这两类细胞，再输回患者体内实现肿瘤大面积杀伤治疗。 CLS多细胞生物免疫治瘤 -有效延长生命长度 3-5年 ,保证提升生物质量 ,实现瘤自我康复 .细胞培养前景l 胚胎干细胞是人体发展的初始阶段，胚胎干细胞被认为是治疗修复人体的最好材料。美国奥巴马总统上任后的第一个