第9章dna序列分析

第九章 DNA序列分析第一节 Maxam-Gilbert化学降解法第二节 Sanger链终止法第三节 DNA片段序列测定的策略第四节 核苷酸序列的生物信息分析第一节 Maxam-Gilbert化学降解法化学降解法 ：人们用专一性作用于 A、 T、 G、 C碱基的化学药剂分别处理经内切酶切割而成的一定长度 DNA片段，通过控制反应时间，既可获得分别以 A、 T、 G、 C为结尾的四组由所有可能长度核苷酸片段组成的 DNA片段群。除了要研究与 DNA的高级结构、 DNA-蛋白质结构相关性采用化学降解法外， 对于单纯以测序为目的的实验，普遍采用后面所讲的酶促合成法。 第二节 Sanger链终止法 1977年 Sanger设计了一种通过 DNA复制来识别 4种碱基的方法，进行 DNA序列测定，即双脱氧链终止法。 Sanger法获得诺贝尔化学奖。一、 Sanger双脱氧链终止法原理在模板指导下， DNA聚合酶不断将 dNTP加到引物的 3-OH 末端，使引物延长，合成出新的互补的 DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷 (ddNTP)，由于双脱氧核糖的 3 位置上缺少一个羟基，故不能同后续的 dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同 5- 引物端和以 ddNMP残基为 3 端结尾的一系列长短不一片段的混合物。 由于双脱氧核苷酸在每个 DNA分子中掺入的位置不同， 采用聚丙烯酰胺凝胶 电泳区分长度差一个核苷酸的单链 DNA，从而读取 DNA核苷酸序列。 二、双脱氧终止法测序反应体系 ：DNA聚合酶单链 DNA模板带有 3-OH末端的单链寡核苷酸引物Mg2+4种 dNTP (aATP、 dGTP、 dCTP和 dTTP)4种 ddNTP (ddATP、 ddGTP、 ddCTP和 ddTTP)Sanger法 DNA测序的试剂 引物：通常由 20-23个碱基构成， G+C=12， A+T=8到11， Tm=60-68 ，避免形成引物二聚体或形成发卡样结构 模板 DNA聚合酶 2,3-双脱氧核苷三磷酸（ 2,3-dideoxynucleoside triphosphate, ddNTP） dNTP三、测序反应的种类 引物标记法 (Dye primer reactions) 终止物标记法 (Dye terminator reactions)This figure shows the structure of a dideoxynucleotide (notice the H atom attached to the 3 carbon). Also depicted in this figure are the ingredients for a Sanger reaction. Notice the different lengths of labeled strands produced in this reaction.This figure is a representation of an acrylamide sequencing gel. Notice that the sequence of the strand of DNA complementary to the sequenced strand is 5 to 3 ACGCCCGAGTAGCCCAGATT while the sequence of the sequenced strand, 5 to 3, is AATCTGGGCTACTCGGGCGT 测序过程 : 1. 模板与引物杂交 2. 引物的延长和合成阻断四个试管分别加入： DNA聚合酶、 dNTPs、标记引物终止剂不同： ddA、 ddG、 ddC、 ddT四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链 3. 电泳： ACGT次序，高压电泳 4. 放射自显影得到直读图象第三节 DNA片段序列测定的策略 人类基因组计划的核心内容之一是基因组测序。随着人类基因组图谱趋于完成，人类基因的定位克隆、鉴定分析直至全基因组测序取得了突破性进展，测序策略的成熟、测序方 法的改进、自动测序仪的广泛应用、计算机数据分析系统的扩展以及测序分析能力的提高，大大推进了大规模 DNA测序的进程。一、定向测序策略 定向测序策略是从 一个大片段 DNA的一端开始按顺序进行 分析。传统的方法是用高分辨率限制酶切图谱确定小片段的排列顺序，然后将小片段亚克隆进合适的克隆载体并进行序列分析。二、随机测序战略 随机测序战略又称 鸟枪战略 (shotgun strategy)，此策略是将人类基因组 DNA用机械方法随机切割成 2kb左右的小片段，把这些 DNA片段装入适当载体，建 立亚克隆文库，从中随机挑取克隆片段。最后通过克隆片段的重叠组装确定大片段 DNA序列。 三、多路测序战略 多路测序战略 (Multiplex method)是鸟枪法的一种发展策略，是通过多个随机克隆同时进行电泳及阅 读，快速分析DNA序列的一种技术。这种方法的复合随机克隆文库来源于相同的基因组 DNA。 将 DNA片段克隆到 20种不同的质粒载体上，再亚克隆进不同的质粒载体。将来源 20个亚克隆库的克隆进行测序。四、大规模 DNA测序的趋势自动化 DNA测序实现规模化的重要条件是自动化和机械化。目前， DNA制备、克隆文库组建及筛选、 DNA测序分析、数据的分析获得、碱基序列阅读、重叠克隆群顺序排定等过程 均已平行发展，自动化操作紧随其后。随着 DNA测序不断由半自动化向自动化过渡，原始数据积累将不成问题，关键是把全基因的散测序组装起来，以实现 DNA测序的完整性。目前，在亚克隆筛选、模板制备、测序反应、碱基阅读等方面均在一定程度上实现了自动化。1、 克隆筛选从亚克隆文库中寻找并筛选单一克隆已逐步实现了自动化。 2、 模板制备 现有的机器人被用来自动分离 DNA并制备适于传统操作程度的测序模板。特定用途的 DNA分离仪也已采用。 3、 测序反应由于手工测序不能保证所需的再生产能力、高通量和准确的重复性，所以， DNA测序反应的自动化对大规模测序是至关重要的。4、 自动放射性自显影阅读机 近几年来，自动化放射性自显影阅读机纷纷上市，并不断向商业化及科研应用方向发展。 5、 自动测序仪 DNA自动测序仪的应用实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化 。310型全自动遗传分析仪DNA全自动分析仪：ABI Prism 3100遗传分析仪 3700型全自动遗传分析仪 安玛西亚 DNA序列分析系统型号：MegaBACE 500/1000/4000 分析仪器的新发展：377型遗传分析仪 3730型遗传分析仪377型 DNA全自动测序仪采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，结合美国应用生物系统 (ABI)公司专利的四色荧光标记，激光检测，一个泳道检测的方法，一个测序反应保证 500bp的准确序列。3730型 DNA全自动测序仪采用毛细管电泳，速度更快，效果更好，通量更大，一个测序反应保证 800bp的准确序列，是当前基因测序的主打。优点 ： i. 四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间；ii. 可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影；iii.可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。缺点 ：无法保留原始记录 , 四个反应产物点在一条道上 , 相互间会发生干扰 , 导致读序时分辨率下降。DNA序列分析自动化包括两个方面的内容，一是指 “分析反应 ”的自动化，另一方面则是指 “读片过程 ”的自动化。西南大学生物技术专业 基因工程 25一、在线分析的核心网站http:/bip.weizmann.ac.il/tools/#primaryhttp:/www.ebi.ac.uk/embl/http:/www.ddbj.nig.ac.jp/二、本地分析的重要软件Vector NTI Suite 6.0及以上的版本：综合分析、载体分析。DNA Star：综合分析Primer Premier 5.0：引物