第五章固定化酶和细胞

Chapter 5 Immobilized Enzyme and Cell固定化酶和细胞制作：郑穗平酶应用过程中的主要瓶颈酶应用过程中的主要瓶颈l 酶的稳定性较差 ： 除了某些耐高温的酶，如 - 淀粉酶、 Taq酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的 pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。 l 酶的一次性使用 ：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。 l 产物的分离纯化较困难 ：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。 固定化技术Contents of chapter 51、什么是固定化技术和固定化酶2、固定化酶的研究历史3、酶的固定化技术4、固定化酶的特点GoGoGoGo6、细胞、原生质体的固定化，自学5、固定化酶的应用Go1 什么是固定化酶？水溶性酶 水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术化学偶联酶固定化间歇可溶交联包埋吸附间歇 连续酶的固定化技术和固定化酶固定化酶的三种形式固定化酶：经提取和分离纯化后的酶固定化菌体 (死细胞 )：含酶菌体或菌体碎片 固定化细胞：在一定的空间范围内进行生命活动的细胞 l 优点 ：1. 不溶于水，易于与产物分离；2. 可反复使用；3. 可连续化生产；4. 稳定性好。l 缺点：1.固 定化过程中往往会引起酶的失 活2.固定化酶在化学催化反应中存在空间位阻l 固定化酶的研究从 50年代开始， 1953年德国的 Grubhofer和 Schleith采用 聚氨基苯乙烯树脂 为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。l 60年代后期，固定化技术迅速发展起来。 1969年，日本的千烟一郎首次在工业上生产应用 固定化氨基酰化酶从 DL-氨基酸连续生产 L-氨基酸 ，实现了酶应用史上的一大变革。l 在 1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为 Immobilized enzyme。2 固定化酶的研究历史l 随着固定化技术的发展，出现 固定化菌体 。 1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产 L-天门冬氨酸。l 在固定化酶和固定化菌体的基础上， 70年代后期出现了固定化细胞 技术。 1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精， 1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。l 1982年，日本首次研究用 固定化原生质体 生产谷氨酸，取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方向。本章目录3 酶固定化技术l 活性中心 ：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。l 功能基团 ：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合l 酶的高级结构 ：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。固定化酶操作的注意事项酶和细胞固定化的模式酶和细胞固定化的模式吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。常用的固体吸附剂有 活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石 等。操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。由于靠物理吸附作用， 结合力较弱 ，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。 包埋法 将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。根据载体材料和方法的不同，可分为：凝胶包埋法： 将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。 半透膜包埋法： 将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等 首先被采用包埋法的酶有： 固定化胰蛋白酶 固定化木瓜蛋白酶 固定化 淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉双丙 烯 酰胺，丙烯酰胺，引发剂海藻酸钙包埋法装置将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶或细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用 CaCl2 溶液），使海藻酸钠中的 Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。颗粒大小可实时监控脂质体包裹酶结合法选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法。根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：离子键结合法： 通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有 DEAE-纤维素 、 TEAE-纤维素 、 DEAE-葡聚糖凝胶 等。 共价键结合法： 通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有： 纤维素 、 琼脂糖凝胶 、 葡聚糖凝胶 、 甲壳质 、 氨基酸共聚物 、 甲基丙稀醇共聚物 等。酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使 载体活化 ，交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应， 形成席夫（ Schiff）碱 ，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。交联法制备的固定化酶或固定化菌体 结合牢固 ，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大 ，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的 颗粒较小 ，给使用带来不便。为此， 可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短 。 常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。酶分子；（ a） 酶分子之间用双功能基团的化学交联 试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（ b）酶分子被 偶联到水不溶性载体上 形成水不溶性的固定化酶本章目录酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酵母细胞表面展示技术酵母细胞表面展示技术NHC H 2C H 2OPOOONH 2 OHOO HO HO HOPOOOC H 2 C H C H 26R1-2Mana 1-2Mana1-6R2Mana1-4Glc a1-Plasma membraneProteinEthanalamine phasphate bridgeGlycanInositol脂肪酶在毕氏酵母表面展示与筛选脂肪酶在毕氏酵母表面展示与筛选C. antarctica 脂肪酶脂肪酶 B及及 M. miehei 脂肪酶基因在酵母细胞脂肪酶基因在酵母细胞表面的展示表面的展示 4 固定化酶的特性：l 将酶或含酶菌体固定化制成固定化酶或固定化菌体以后，由于受到载体等的影响， 酶的特性可能会有些变化。 l 固定化酶的 稳定性 一般比游离酶的稳定性好。 l 固定化酶的 最适作用温度 一般与游离酶差不多， 活化能 也变化不大。 l 酶经过固定化后，其作用的 最适 pH值 往往会发生一些变化。这一点在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适 pH值的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质。l 固定化酶的 底物特异性 与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。 固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。 本章目录乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酰 -D AlaAminoacylase氨 基 酰 化 酶5 固定化酶的应用世界上第一种工业化生产的固定化酶。 1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用 DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将 L-乙酰氨基酸水解生成 L-氨基酸，用来拆分 DL-乙酰氨基酸，连续生产 L-氨基酸。剩余的 D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成 DL-乙酰氨基酸，再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的 60左右。 泵储罐反应产物离心机消旋反应器固定化酶柱子晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-AlaDL-乙酰氨基酸拆分高果糖浆的生产世界上生产规模最大的一种固定化酶。将培养好的含 葡萄糖异构酶 的放线菌细胞用 60 65 热处理15min，该酶就固定在菌体上，制成固定化酶，催化葡萄糖异构化生成果糖，用于连续生产果葡糖浆。 *生产果葡糖浆的固定化酶反应器K. Buchholz, et al.(Germany) ,2005; 2008This is the largest process performed with about 1500 t of immobilized enzymes producing a glucosefructose syrup (HFCS, high fructose corn syrup) with more than 10 million t of product (dry matter) per year Typical fixed bed reactor 1220 t (dry substance, d.s.) per kg of biocatalyst with a half-life of 80150 days. Reactor dimensions typically are 1.5 m diameter and 5 m height of fixed bed bioreactors, with operation at 5860 C青霉素酰化酶转化填充床反应器连续生产 (R)-1,3-丙二醇 b. 固定化生物催化剂在异丙醇 -水溶液体系中进行不对称氢转移生物还原 n 底物 4-羟基 -2-丁酮 5%n 产物 (R)-1,3-丁二醇 49.5 g/ln 光学纯度 99%e.e. n 转化率为 99% n 反应器稳定工作 500 hn 反应器的生产率约为750 mg/h/10 ml (催化剂 ) （ Nobuya Itoh,2007） a. 固定化 E. coli 细胞生物催化不对称氧化还原 CO2合成甲醇 （ Ei-Zahab, et al. 2008； Matsuda T. et al. 2009 ） n 四种酶 ， 包括甲酸、甲醛、乙醇和谷氨酸脱氢酶共固定化在一种颗粒上n 辅酶 NADH固定在另颗粒上n 向两种固定化颗粒的悬浮液中通 CO2气体进