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第二十章 免疫检验自动化仪器分析1了解免疫检测自动化的基本概念2了解免疫检测自动化设计的基本原理3了解免疫检测自动化仪器在临床上的应用4掌握常用的几种免疫检测自动化仪器的检测原理、应用以及评价,本章重点免疫检验自动化(automation of immunoassays) 是将免疫学反应检测过程中的取样、加试剂、混合、温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、打印报告和检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制,自动化进行。第一节 自动化免疫浊度分析系统免疫浊度分析属液相沉淀试验,其基本原理是:抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应,形成小分子免疫复合物( 19S),使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下,形成的免疫复合物量随抗原量的增加而增加,反应液的浊度亦随之增大,即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。 一、免疫透射比浊法【 原理 】 一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的溶液时,被其中的免疫复合物微粒吸收、反射和折射而减弱 (图 9-7),在一定范围内,吸光度与免疫复合物量呈正相关,而形成的免疫复合物量与参与反应的抗原和抗体的量呈函数关系。与已知浓度的抗原标准品比较,可确定标本中抗原含量。二、免疫胶乳比浊法 原理 用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒 (一般为0.2 m), 在遇到相应抗原时,胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合,引起胶乳颗粒凝聚 ,使 透射光和散射光即出现显著变化。如图所示: a为单个胶乳颗粒不阻碍光线透过, b为抗原抗体结合形成的凝聚胶乳大颗粒使透射光减弱或散射光增强。 三、免疫散射比浊法【 原理 】 粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光线照射后,微粒子对光线产生反射和折射而形成散射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因素密切相关,其公式如下:式中 I为与入射光成 角处散射光强度; 和 I0为入射光的波长和强度; dn/dc为校正因子,反映了溶液折射指数和颗粒浓度的变化; M为颗粒分子量; c为浓度; N为阿佛加德指数; 为颗粒到检测器的距离; 为散射光与入射光的夹角(散射夹角)。I I0 42( dn/dc) 2 Mc(1+cos)N24颗粒直径 1/10 Rayleigh 散射1/10颗粒直径 Debye 散射颗粒直径 Mile 散射 定时散射比浊法( fixed time nephelometry) 定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下,加入待测抗原,此时反应立即开始,在反应的第一阶段,溶液中产生的散射光信号波动较大,所获取的信号计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法是避开抗原抗体反应的不稳定阶段,即散射光信号在开始反应 7.5s 2min内的第一次读数,专门在抗原抗体反应的最佳时段进行读数,将检测误差降到最低。 速率散射比浊法( rate nephelometry) 速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测定法。所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的速度(不是免疫复合物累积的量),连续测定各单位时间内复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起,形成动态的速率散射比浊法,每项检测仅 1min 2min即可完成。 表 抗原抗体复合物形成的速率 累计时间( s) 形成 IC总量 速率 累计时间( s) 形成 IC总量 速率5 8 10 13 515 25 1220 60 3525 150 9030 230 8035 300 7040 360 6045 415 5550 450 4555 480 3060 500 20抗原抗体反应速率的动态变化BN ProSpec全自动特定蛋白分析仪lBNP防抗原过量的设计 :l 优化反应条件,令初始稀释度分析范围更宽,保证抗原抗体反应呈最佳比例l 预反应程序: IgM, LamU, AlbU, 2MUl VLinIntegral计算程序定时散射比浊法测定原理示意图 IMMAGE全自动特定蛋白分析仪一、特异性二、比例性三、可逆性一、抗体来源:兔,羊, -二、亲合力三、浓度四、电解质, (增浊剂 )五、 pH六、温度抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的影响因素抗体l抗体的质量特异性强,效价高,亲和力强, R型l抗体的含量抗体过量l抗体的特异性抗体只针对相应的抗原,非特异性的交叉反应会引起伪浊度。l抗体的效价一个合格的比浊用抗体其效价必须在 1: 20(抗体稀释度)以上,否则易形成伪浊度。l抗体的亲和力亲和力强则抗体活性高,不仅可以加快抗原抗体反应速度,而且形成的免疫复合物较牢固,不易发生解离。lR型抗血清以家兔为代表的小动物血清,如豚鼠、大白鼠、家兔、家禽、羊等动物的免疫血清。这类抗血清亲和力高,与抗原结合后不易再解离,抗体过剩时易形成大而稳定的复合物,抗原过剩时则形成可溶性复合物。lH型抗血清以马为代表的大动物血清,如驴、骡、马等动物的免疫血清。该
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