保健食品抗疲劳作用试验方法研究

DOI ：10. 13590/j. c jfh. 1997. 04. 002扁者按自中华人民共和国食品卫生法对保健食品进行法制化管理以来，我国的保健食品研究 出现了新的高潮。本刊选登了一些文章。这些文章既有管理方面的，也有检验方面的，检验包 括功能性试验和有效成分的检验。作者们在研究中进行了大量的探索与实践，在有些方面取 得了共识，在有些方面有不同的见解。无论是共识还是不同见解，都是令人可喜的，都是对保 健食品研究的推动。欢迎进行保健食品研究的同志们积极参与研究和讨论，百花齐放、百家争 鸣，将保健食品的研究引向深入。仑著保健食品抗疲劳作用试验方法研究何 来 英 严 卫 星 楼 密 密 冯 永 全刘 红蕾卫 生 部 食 品 卫 生 监 督 检 验 所 （ 100021)摘 要 为 评 价 各 种 抗 疲 劳 作 用 保 健 食 品 的 功 效 ， 建 立 了 一 套 试 验 方 法 ， 包 括 ： 运 动 耐 力 试 验 (游 泳 试 验 ） 、 肝 糖 原 、 血 清 尿 素 氮 和 血 乳 酸 测 定 。 经 过 反 复 验 证 ， 证 明 所 建 方 法 稳 定 、 可 靠 ， 能真 实 地 检 测 出 产 品 的 实 际 功 效 。 可 操 作 性 强 ， 仪 器 要 求 简 单 ， 除 乳 酸 测 定 仪 外 ， 无 需 其 它 特 殊 的 仪 器， 一 般 实 验 室 都 能 开 展 实 验 。关 键 词 保 健 食 品 疲 劳 运 动 耐 受 性 肝 糖 原 血 尿 素 氮 乳 酸 盐 类 小 鼠1疲 劳 的 概 念在 近 百 年 来 的 研 宄 中 ， 提 出 过 多 种 有 关 疲 劳 的 概 念 ， 其 中 影 响 较 大 的 是 1935年 E. Simonson提 出 的 疲 劳 概 念 ， 111认 为 疲 劳 时 存 在 四 个 基 本 过 程 ：(1) 代 谢 基 质 疲 劳 产 物 的 积 累 （ 积 累 假 说 ）(2) 活 动 所 需 基 质 耗 竭 （ 衰 竭 学 说 )；(3) 基 质 的 生 理 化 学 状 态 改 变 ；(4) 调 节 和 协 同 机 能 失 调 。1982年 在 第 5次 国 际 运 动 生 化 学 术 会 议 上 ， 将 疲 劳 定 义 为 :机 体 生 理 过 程 不 能 持 续 其 机 能 在 某 一 特 定 的 水 平 和 /或 不 能 维 持 预 定 的 运 动 强 度 。 运 动 性 疲 劳 可 分 为 躯 体 性 疲 劳 和 心 理 性 疲 劳 。 111躯 体 性 疲 劳主 要 表 现 为 运 动 能 力 下 降 ， 心 理 性 疲 劳 主 要 表 现 为 行为 的 改 变 。 所 谓 抗 疲 劳 ， 就 是 延 缓 疲 劳 的 产 生 和 /或 加 速 疲 劳 的 消 除 。2材 料 和 方 法 2.1选 择 方 法 的 依 据躯 体 性 疲 劳 是 由 运 动 引 起 机 体 一 系 列 生 化 改 变 而 导 致 的 肌 肉 力 量 下 降 。 因 此 ， 疲 劳 的 评 价 方 法 主 要 有 两 种 ： 耐 力 试 验 和 生 化 改 变 的 检 测 。 疲 劳 的 宏 观 表 现 主 要 是 运 动 时 能 量 体 系 输 出 的 最 大 功 率 下 降 和 肌 肉 力 量 下 降 。 测 定 机 体 持 续 运 动 至 力 竭 的 时 间 可 以 反 映 机 体 的 耐 力 。 运 动 时 在 机 体 出 现 疲 劳 的 感 觉 之 前 ， 机 体 己 发 生 了 各 种 生 化 改 变 ， 也 正 是 由 于 这 些 生 化 改 变 才 导 致 了 疲 劳 感 觉 的 发 生 。 因 此 可 以 用 引 起 疲 劳 的 生 化 指 标 来 研 宄 疲 劳 的 发 生 及 其 发 展 变 化 过 程 。 生 化 指 标 有 以 下 几 类 ： （ 1)能 量 物 质 ： 血 糖 、 肝糖 原 、 肌 糖 原 、 磷 酸 肌 酸 。 （ 2)代 谢 调 节 物 质 ： 酶 、 激素 . (3)代 谢 产 物 ： 血 和 肌 肉 中 的 乳 酸 、 氢 离 子 浓 度 、 丙酮保 健 食 品 抗 疲 劳 作 用 试 验 方 法 研 究 何 来 英 严 卫 星 楼 密 密 等 1酸 、 血 尿 素 氮 等 。 但 并 非 所 有 因 运 动 而 变 化 的 生 化 指 标 都 适 合 作 为 疲 劳 或 抗 疲 劳 作 用 的 评 价 指 标 ， 因 为 运 动 负 荷 的 大 小 与 机 体 的 生 化 改 变 程 度 并 不 都 是 一 致 的 ， 只 有 运 动 时 变 化 明 显 、 其 变 化 程 度 与 运 动 负 荷 和 强 度 一 致 的 指 标 才 能 作 为 疲 劳 或 抗 疲 劳 的 评 价 指 标 。 作 为 保 健 食 品 功 能 学 评 价 的 常 规 检 测 指 标 ， 还 应 具 有 检 测 方 法 灵 敏 、 操 作 简 便 易 行 、 检 测 结 果 能 客 观 反 映 机 体 的 疲 劳 程 度 等 特 点 。 考 虑 到 以 上 因 素 ， 我 们 选 择 运 动 耐 力 试 验 和 肝 糖 原 、 血 清 尿 素 氮 、 血 乳 酸 3项 生 化 指 标 。2.1.1 运 动 耐 力 试 验疲 劳 的 最 主 要 表 现 是 运 动 耐 力 的 下 降 ， 运 动 耐 力 是 反 映 机 体 疲 劳 最 直 接 、 最 客 观 的 指 标 。 运 动 耐 力 的 测 定 方 法 有 运 动 跑 台 、 爬 杆 和 游 泳 。 运 动 跑 台 有 滚 筒 式 和 平 板 式 两 种 ， 该 装 置 较 贵 ， 不 便 于 推 广 。 爬 杆 装 置 简 单 ， 但 有 的 小 鼠 并 非 因 疲 劳 落 地 ， 而 是 不 愿 爬 才 跳 下 来 的 ， 并 且 因 小 鼠 趾 甲 的 抓 损 和 杆 的 光 洁 度 等 因 素 很 难 保 持 一 致 ， 因 此 爬 杆 实 验 结 果 不 如 游 泳 试 验 结 果 可 靠 。 游 泳 试 验 装 置 简 单 ， 且 实 验 结 果 能 客 观 地 反 映 机 体 的 体 能 ， 最 为 常 用 。2.1.2肝 糖 原 测 定机 体 供 能 物 质 有 糖 、 脂 肪 和 蛋 白 质 ， 糖 是 肌 肉 活 动 时 能 量 的 重 要 来 源 。 大 强 度 运 动 2h左 右 ， 肌 糖 原 近 于 耗 竭 。 长 时 间 紧 张 运 动 中 体 力 的 衰 竭 总 是 和 肌 糖 原 的 耗 竭 同 时 发 生 ， 121因 此 糖 原 的 含 量 能 说 明 疲劳 发 生 的 快 慢 或 程 度 。 肌 糖 原 消 耗 的 同 时 ， 为 维 持 血 糖 水 平 ， 肝 糖 原 储 备 量 减 少 。 如 果 受 试 物 组 肝 糖 原 明 显 高 于 对 照 组 ， 且 差 异 有 显 著 性 ， 则 说 明 该 受 试 物 能 够 通 过 增 加 肝 糖 原 储 备 或 /和 减 少 运 动 时 肝 糖 原 的 消 耗 ， 从 而 为 机 体 提 供 更 多 的 能 量 来 达 到 抗 疲 劳 的 目 的 。 因 此 ， 肝 糖 原 含 量 是 一 个 较 敏 感 的 指 标 。2.1.3血 清 尿 素 氮 测 定运 动 时 的 供 能 物 质 有 糖 、 脂 肪 和 蛋 白 质 。 一 般 运 动 时 间 不 超 过 30 min时 ， 蛋 白 质 较 少 参 与 供 能 ， 血 尿 素 氮 变 化 不 明 显 ； 较 长 时 间 运 动 后 ， 当 机 体 长 时 间 不 能 通 过 糖 、 脂 肪 分 解 代 谢 获 得 足 够 的 能 量 时 ， 蛋 白 质 与 氨 基 酸 分 解 代 谢 加 强 ， 血 尿 素 氮 才 明 显 增 加 。 机 体 血 尿 素 氮 含 量 随 运 动 负 荷 的 增 加 而 增 加 。 身 体 对 负 荷 的 适 应 性 越 差 ， 则 产 生 的 尿 素 氮 越 多 。 且 蛋 白 质 分 解 代 谢 加 强 不 仅 发 生 在 不 适 应 的 运 动 时 ， 还 会 延 续 到 运 动 后 的 休 息 期 ， 血 中 尿 素 氮 可 在 运 动 后 较 长 时 间 持 续 升 高 。2. 1.4血 乳 酸 测 定剧 烈 运 动 时 ， 机 体 相 对 缺 氧 ， 糖 酵 解 加 快 ， 产 生 大 量 乳 酸 ， 使 肌 肉 中 H+浓 度 上 升 ， pH值 下 降 ， 导 致 疲 劳 。 乳 酸 在 体 内 的 积 累 取 决 于 乳 酸 的 产 生 与 消 除 速 度 .因 此 ， 减 少 乳 酸 的 产 生 或 加 快 乳 酸 的 消 除 ， 都 可 延 缓 疲 劳 发 生 和 /或 加 速 疲 劳 的 消 除 。 血 乳 酸 水 平 可 以 反 映 有 氧 代 谢 能 力 、 疲 劳 的 产 生 和 消 除 速 度 。24材 料 2.2. 1 实 验 动 物昆 明 种 小 鼠 ， 雄 性 ， 体 重 1822g购 自 军 事 医 学 科 学 院 动 物 繁 育 中 心 。 设 受 试 物 高 、 中 、 低 3个 剂 量 组 ， 溶 剂 对 照 和 水 对 照 （ 如 溶 剂 为 水 ， 则 只 设 水 对 照)， 每 项 试 验 共 4或 5个 组 ， 每 组 15只 。剂 量 设 置 一 个 剂 量 组 为 人 体 推 荐 量 的 10倍 (小 鼠 与 人 的 等 效 剂 量 约 为 10倍 )， 往 上 或 下 再 设 2 个 剂 量 组 (最 大 不 超 过 人 体 推 荐 量 的 30倍 ）2.2.2仪 器 与 器 材乳 酸 测 定 仪 （ 美 国 Yellow公 司 产 品 ） 、 乳 酸 测 定 膜 （ 美 国 YeUow公 司 产 品 ） 、 匀 浆 器 、 天 平 、 分 光光 度 计 、 离 心 机 、 振 荡 器 。 游 泳 箱 、 铅 皮 （ 购 自 渔 具 店 ）、 解 剖 器 械 、 温 度 计 、 表 、 锅 、 电 炉 、 试 管 、 平 皿 、 滤 纸、 12. 0 mL和 0. 5 mL塑 料 离 心 管 、 毛 细 管 （ 20 PL)、 离 心 管 等 。2.2.3 试 剂蒽 酮 试 剂 中 含 0.05%蒽 酮 ， 1%硫 脲 ， 用 72% 硫 酸 配 制 。 蒽 酮 试 剂 的 配 制 方 法 :131 72%硫 酸 的 配 制 ： 烧 杯 中 加 入 280 mL蒸 馏 水 ， 再 加 入 高 纯 度 浓 硫 酸 （ 分 析 纯 、 比 重 1. 84 ) 720 mL 蒽 酮 试 剂 配 制 ： 当 硫 酸 温 度 降 至 8090C时 加 入 500 mg纯 蒽 酮 ， 10 g 高 纯 度 的 硫 脲 ， 适 当 摇 动 烧 杯 混 匀 。 冷 却 后 存 于 冰 箱 中 ， 可 保 存 两 周 。 最 好 现 用 现 配 。尿 素 氮 测 定 试 剂 盒 （ 二 乙 酰 一 肟 应 用 液 、 氯 化 铁 磷 酸 应 用 液 、 20 mg/dL尿 素 氮 标 准 液 ） 。 测 定 乳 酸 用 的 乳 酸 标 准 液 、 缓 冲 液 和 破 膜 液 （ 均 为 美 国 YeUow公 司 产 品 )。24方 法 2.3.1游 泳 试 验为 缩 短 游 泳 时 间 ， 一 般 采 用 负 重 游 泳 的 方 法 。 连 续 经 口 给 予 受 试 物 30d， 于 末 次 给 样 30min后 ， 鼠 尾 根 部 负 小 鼠 体 重 5%的 铅 皮 ， 放 入 水 温 为 25 C、 水 深 35cm(般 不 少 于 25cm)的 游 泳 箱 中 。 每 一 批 小 鼠 下 水 之 前 均 将 水 温 调 至 25 C， 并 将 室 温 恒 定 在 25Q 每 只 水 箱 一 次 放 入 5只 小 鼠 .用 秒 表 记 录 自 游 泳 开 始 至 力 竭 死 亡 的 时 间 ， 该 时 间 为 小 鼠 的 游 泳 时 间 。 试2 中 国 食 品 卫 生 杂 志 第 9卷 第 4期验 结 果 用 方 差 分 析 或 t检 验 。 如 果 受 试 物 组 游 泳 时 间 比 对 照 组 长 ， 且 差 异 有 显 著 性 ， 则 可 判 断 为 该 受试 物 可 延 长 小 鼠 游 泳 时 间 。2.3.2肝 糖 原 测 定连 续 经 口 给 予 受 试 物 30d于 末 次 给 样 30min 后 ， 将 小 鼠 置 于 水 温 为 30 C的 游 泳 箱 中 不 负 重 游 泳 90min(每 箱 一 次 放 入 5只 ） ， 每 次 入 水 前 均 将 水 温 调 至 30C， 室 温 恒 定 在 25C游 泳 后 立 即 处 死 取 肝 。 用 经 典 的 蒽 酮 法 138测 定 肝 糖 原 的 含 量 。具 体 操 作 步 骤 如 下将 肝 置 于 冰 上 的 平 皿 内 ， 经 生 理 盐 水 漂 洗 后 用 滤 纸 吸 干 ， 精 确 称 取 200 mg肝 放 入 离 心 管 内 ， 加 入 5% 的 三 氯 醋 酸 4 mL用 匀 浆 器 （ 28000 r/min)匀 浆 1 min后 于 3000 r/ min离 心 15 min将 上 清 液 移 入 另 一 试 管 内 。 于 沉 淀 内 加 入 5%的 三 氯 醋 酸 4mL再 匀 浆 1 min后 离 心 15 min， 将 上 清 液 移 入 试 管 内 与 第 一 次 离 心 的 上 清 液 合 并 ， 用 振 荡 器 充 分 混 匀 。 取 此 上清 液 1 mL放 入 10 mL离 心 管 中 ， 加 入 95%或 无 水 乙 醇 4mL充 分 混 匀 至 两 种 液 体 间 不 留 有 界 面 ， 用 干 净 塞 子 塞 上 ， 室 温 下 静 置 过 夜 。 3000 r min离 心 15 min倒 掉 上 清 液 后 让 试 管 倒 置 10 min滤 干 ， 于 各 试 样 管 内 加 入 蒸 馏 水 2mL(标 准 管 加 入 100 mg/dL葡 萄 糖 标 准 液 0.5mL和 蒸 馏 水 1. 5mL试 剂 对 照 管 加 入 蒸 馏 水 2mL)， 振 荡 管 子 至 糖 原 完 全 溶 自 解 用 力 注 入 蒽 酮 试 剂 10 mL， 立 即 置 于 冰 水 内 冷 却 至 室 温 ， 等 所 有 试 管 加 完 后 ， 放 入 沸 水 中 煮 沸 15min(水 浴 深 度 略 高 于 管 子 液 面 )， 立 即 取 出 放 入 冰 水 中 冷 却 至 室 温。 于 620 nm波 长 处 比 色 测 定 吸 光 度 (A )用 下 列 公 式 计 算 每 100g肝 组 织 中 糖 原 的 毫 克 数 。每 100g肝 组 织 中 糖 原 的 毫 克 数 =0.从 0.X 100 x 0. 9DU -试 样 管 吸 光 度DS -标 准 管 吸 光 度为 0.5 mL葡 萄 糖 标 准 液 中 的 葡 萄 糖 含0. 5 量8 为 0.2g肝 组 织 的 提 取 液 体 积0.2 为 取 的 肝 组 织 重 量 （ g)0.9 将 葡 萄 糖 换 算 成 糖 原 的 系 数2.3.3血 清 尿 素 氮 测 定连 续 经 口 给 予 受 试 物 30d， 末 次 给 样 30min后将 小 鼠 放 入 水 温 30， 、 水 深 30 cm的 游 泳 箱 中 ， 每 箱 一 次 放 入 5只 小 鼠 ，不 负 重 游 泳 90 min运 动 后 休 息 60 min将 眼 睛 周 围 擦 干 净 ， 拔 眼 球 取 血 约 0.5 mL 用 二 乙 酰 一 肟 法 151测 定 血 清 尿 素 氮 。 血 清 中 尿 素 氮 在 冰 箱 内 可 稳 定 24 h操 作 步 骤 如 下 将 血 于 4,冰 箱 静 置 3 4h待 凝 固 后 ， 用 针 尖 将 血 自 管 壁 剥 离 ， 平 衡 后 于 1500 r/ min离 心 10 15 min吸 出 血 清 。各 取 20 PL血 清 加 入 试 管 中 （ 标 准 管 加 入 尿 素 氮 标 准 液 20ML试 剂 对 照 管 加 入 蒸 馏 水 20 KL)再 加 入 二 乙 酰 一 肟 应 用 液 3. 0 mL、 氯 化 铁 磷 酸 应 用 液 2. 5 mL用 振 荡 器 充 分 混 匀 。于 沸 水 中 煮 沸 10min立 即 取 出 置 于 冷 水 中 冷 却 至 室 温 ， 于 520 nm波 长 比 色 测 定 吸 光 度 （ A ) 用 下 面 的 公 式 计 算 血 清 尿 素 氮 含 量 ：尿 素 氮 (mg/ dL)= .试 样 .工 白 X 20. 0(mg/ dL)A标 准 A空 白2.3.4血 乳 酸 测 定操 作 程 序 安 静 状 态 下 采 血 ， 然 后 负 体 重 4%的 铅 皮 ， 于 30,水 中 游 泳 10min游 后 立 即 采 血 ， 安 静 15min、 60min后 分 别 采 血 ， 用 乳 酸 测 定 仪 测 定 。试 验 方 法 如 下 连 续 经 口 给 样 30 d于 末 次 给 样 后 30min开 始 ，用 毛 细 管 从 内 眦 采 血 各 20 KL，加 入 40KL破 膜 液 中 ， 充 分 混 匀 至 透 明 。 然 后 按 体 重 的 4%负 重 铅 皮 ， 固 定 于 鼠 尾 根 部 ， 放 入 水 温 30， 、 水深 30 cm的 游 泳 箱 中 （ 为 便 于 控 制 采 血 时 间 ，每 隔 1 min 放 一 只 小 鼠 入 水 )游 泳 10min后 取 出 ，立 即 用 纱 布 或 吸 水 纸 擦 干 水 ，采 血 20ML，再 分 别 于 休 息 15 min和 60 min后 各 采 血 20PL加 入 40PL破 膜 液 中 ，充 分 混 匀 至 液 体 透 明 （ 不 能 产 生 血 凝 块 ， 否 则 影 响 试 验 结 果 ） 。用 乳 酸 测 定 仪 测 定 血 乳 酸 值 （ mmol/ L)。3结 果 与 讨 论3.1游 泳 试 验 试 验 过 程 中 ， 以 下 因 素 明 显 影 响 试 验 结 果 。3.1.1运 动 强 度 有 的 小 鼠 浮 在 水 面 不 游 ， 会 使 游 泳 时 间 显 著 延 长 ，因 此 ，要 得 到 可 靠 结 果 ，必 须 使每 一 只 小 鼠 持 续 游 泳 ，可 用 木 棍 在 小 鼠 周 围 轻 轻 搅 动 。 3.1.2负 重 负 重 物 的 比 重 越 小 ， 浮 力 越 大 ， 小 鼠 游 泳 时 间 越 长 。因 此 负 重 物 的 比 重 应 较 大 。有 的 人 用 牙 膏 皮 （ 铝 ） 作 负 重 物 ，小 鼠 可 游 3 4h (同 等 条 件 下 ， 负 重 铅 皮 的 游 泳 时 间 为 10 min左 右 ） 有 的 用 橡 皮 泥 作 负 重 物 ， 游 泳 过 程 中 橡 皮 泥 可 能 会 散 落 而 使 游 泳 时 间 延 长 。 钓 鱼 用 的 铅 皮 比 重 大 、 浮 力 小 ， 且 质 地保 健 食 品 抗 疲 劳 作 用 试 验 方 法 研 宄 何 来 英 严 卫 星 楼 密 密 等 3软 ， 易 于 裁 剪 和 捆 绑 ， 是 较 理 想 的 负 重 材 料 。 负 重量 以 小 鼠 体 重 的 5%为 宜 ， 负 重 物 太 重 则 小 鼠 下 沉 ， 太 轻 则 游 泳 时 间 太 长 ， 不 便 于 操 作 。 实 验 时 将 铅 皮 固定 于 鼠 尾 的 根 部 ， 固 定 的 松 紧 度 应 适 宜 ， 太 紧 ， 鼠 尾血 液 循 环 不 畅 ， 鼠 尾 发 紫 ， 同 时 ， 其 功 能 会 受 影 响 而 缩短 游 泳 时 间 。3.1.3水 温 水 温 在 30C左 右 时 小 鼠 的 游 泳 时 间最 长 ， 水 温 过 高 、 过 低 都 会 缩 短 其 游 泳 时 间 。 为 便 于 操 作 ， 我 们 选 用 25C水 温 ， 该 温 度 下 既 不 至 使 小 鼠游 泳 时 间 太 长 ， 又 不 会 使 小 鼠 肌 肉 痉 挛 （ 水 温 过 低 时 肌 肉 痉 挛 ， 影 响 试 验 结 果 )。 实 验 时 应 尽 量 使 环 境 温 度 保 持 衡 定 在 25C以 免 水 温 下 降 而 缩 短 游 泳 时 间 . 各 游 泳 箱 水 温 相 差 不 超 过 0. 1C。 不 同 条 件 下 的 游 泳 时 间 见 表 1表 1不 同 条 件 下 小 鼠 的 游 泳 时 间游 泳 条 件 不 负 重 25 C 负 重 5%、 30C 负 重 5% 25 C日 期 96. 4.19 96 .6 .6 96 .7 .9动 物 数 10 16 12游 泳 时 间 s 9300士 2478 1224 .5 士 469 .5 405.0 士 151. 2由 表 1可 见 ， 25 C负 重 5%时 ， 游 泳 时 间 最 为 3.1.4小 鼠 的 批 次 不 同 批 次 的 小 鼠 （ 体 重 35g左 合 适 (一 般 在 5 15 min)游 泳 时 室 温 与 水 温 相 同 ， 右 ） 其 游 泳 时 间 不 同 ， 但 相 对 稳 定 ， 一 般 在 5 15 min 每 箱 一 次 同 时 放 入 5只 小 鼠 . 数 据 见 表 2表 2同 一 条 件 下 不 同 批 次 小 鼠 的 游 泳 时 间日 期 96. 7. 8 96 7 9 96 8 16 96 8 19 96 11 19 96 12 17动 物 数 12 12 15 15 12 15游 泳 时 间 s 371.7 士 135. 6 405. 0 士 151. 2 554.9 士 186. 4 577.7 士 204. 9 648 8 士 267 4 341. 3 士 140. 2由 表 2可 见 不 同 批 次 小 鼠 的 游 泳 时 间 不 同 ， 但 相 对 稳 定 。 游 泳 条 件 为 ： 水 温 25C负 重 5%的 铅 皮 。 游 泳 时 室 温 与 水 温 相 同 。3.1.5水 深 及 游 泳 箱 面 积 的 大 小 水 深 一 般 不 低 于 25 cm若 太 浅 ， 小 鼠 力 竭 下 沉 时 可 用 脚 蹬 底 而 重 新 浮 出 水 面 ， 至 使 游 泳 时 间 延 长 。 水 的 面 积 宜 大 不 宜 小， 一 般 不 小 于 50 cmX 50 cm。3.1.6游 泳 箱 内 一 次 放 入 的 小 鼠 数 一 个 水 箱 内 同 时 放 入 的 小 鼠 数 不 能 太 多 ， 否 则 互 相 挤 靠 、 踩 碰 ，容 易 呛 水 而 缩 短 游 泳 时 间 。 同 时 放 入 的 小 鼠 数 越 多 ， 游泳 时 间 越 短 。 因 此 ， 同 一 试 验 的 各 剂 量 组 一 个 水 箱 内同 时 入 水 的 小 鼠 数 应 相 同 。 本 测 验 一 次 放 入 5只 . 3.1.7小 鼠 的 性 别 最 好 用 雄 性 小 鼠 ， 其 体 能 受 性 周 期 的 影 响 较 小 。3.2肝 糖 原 测 定试 验 表 明 ， 游 泳 90 min后 小 鼠 肝 糖 原 尚 未 耗 竭 ， 且 与 安 静 组 差 异 有 显 著 性 （ 见 表 3)故 此 时 取 材 比 较 合 适 .水 温 对 小 鼠 游 泳 时 间 影 响 很 大 ， 要 保 证 小 鼠 游 泳 90min而 不 致 死 亡 ， 我 们 选 用 30 C度 。影 响 肝 糖 原 测 定 结 果 的 因 素 有 ：3.2.1运 动 强 度 剧 烈 运 动 2h左 右 可 以 使 肝 糖 原 耗 竭 ， 可 见 ， 运 动 强 度 显 著 影 响 运 动 后 肝 糖 原 的 含量 ， 故 试 验 过 程 中 使 每 一 只 小 鼠 持 续 游 泳 是 获 得 可 靠 结 果 的 关 键 因 素 。 见 表 3表 3运 动 对 肝 糖 原 的 影 响 （ 吸 光 度 A)运 动 情 况 安 静 30C 游 泳 90 min动 物 数 10 10肝 糖 原 (吸 光 度 A ) 1 429 士 0 206 0 436士 0 230P 0. 001由 表 3可 以 看 出 ， 运 动 显 著 影 响 肝 糖 原 的 含 量 。 3.2.2 运 动 开 始 的 时 间 小 鼠 习 性 以 夜 间 活 动 为 主 ， 进 食 也 主 要 在 夜 间 。 试 验 开 始 的 时 间 离 进 食 时间 越 久 ， 测 定 的 肝 糖 原 含 量 越 低 。 我 们 于 上 午 和 下 午分 别 进 行 过 多 次 试 验 ， 结 果 均 表 明 下 午 的 肝 糖 原 含 量极 低 ， 很 难 比 较 各 组 的 差 异 ， 上 午 显 著 高 于 下 午 （ 见表4 中 国 食 品 卫 生 杂 志 第 9卷 第 4期4)因 此 ， 试 验 应 在 上 午 进 行 ， 且 同 一 受 试 物 各 组 应 在 同 一 时 点 进 行 试 验 。由 表 4可 见 ， 同 等 条 件 下 ， 下 午 游 泳 后 肝 糖 原 含 量 极 低 ， 与 上 午 进 行 的 试 验 相 比 ， 差 异 有 极 显 著 性 。 (游 泳 条 件 为 ： 30C、9 0 min)表 4不 同 时 点 游 泳 后 的 肝 糖 原 含 量游 泳 时 点 上 午 8: 309: 30 下 午 2: 003: 00动 物 数 10 10肝 糖 原 (吸 光 度 A ) 0. 583士 0.430 0. 007 士 0. 068P 0. 001表 5不 同 日 期 测 得 的 肝 糖 原 含 量日 期 96.7. 11 96 7 16 96 9 18 96 11 21 96 12 9动 1物 2 数 15 10 13 14肝 糖 原 量 (mg/ 1Wg 肝 ） 57. 5 士 35. 5 565.5 士 324. 5 1928.0 士 1246. 0 11992 0 士 7984. 0 1390.0 士 664. 03.2.3肝 匀 浆 时 间 和 糖 原 提 取 次 数 肝 组 织 匀 浆 时 间 的 长 短 和 糖 原 提 取 的 次 数 均 与 肝 糖 原 的 提 取 率 成 正 比 ， 各 试 样 匀 浆 时 间 和 提 取 次 数 应 保 持 一 致 。3.2.4 显 色 反 应 的 温 度 和 时 间 蒽 酮 法 为 显 色 反 应 ， 反 应 温 度 和 时 间 都 显 著 影 响 反 应 后 颜 色 的 深 浅， 应 严 格 控 制 。 各 次 试 验 测 得 的 肝 糖 原 含 量 差 异 非 常 大 ， 可 相 差 几 百 倍 (见 表 5)因 此 ， 每 次 试 验 必 须 设 有 对 照 组 、 标 准 管 和 空 白 管 .由 表 5可 见 ， 各 次 试 验 测 得 的 肝 糖 原 差 异 可 达 几 百 倍 。 蒽 酮 法 为 显 色 反 应 ， 反 应 温 度 和 时 间 显 著 影响 颜 色 深 浅 ， 因 此 ， 对 照 组 、 标 准 管 和 试 剂 对 照 的 反应 温 度 和 时 间 应 与 受 试 物 组 完 全 一 致 .3.2.5反 应 后 的 测 定 时 间 显 色 反 应 后 应 在 30min 内 完 成 比 色 测 定 ， 时 间 太 长 ， 颜 色 会 逐 渐 变 浅 。3.2.6 试 样 配 方 中 糖 含 量 的 高 低 试 验 中 发 现 ， 有 的 试 样 其 它 抗 疲 劳 试 验 指 标 均 为 阴 性 ， 唯 独 肝 糖 原含量 受 试 物 组 高 于 对 照 组 ， 查 验 配 方 发 现 其 本 身 糖 含量 较 高 。 这 也 说 明 ， 单 一 生 化 指 标 阳 性 不 能 判 定 该 产品 有 抗 疲 劳 作 用 。3.3 血 清 尿 素 氮 测 定运 动 时 间 少 于 30min时 ，蛋 白 质 较 少 参 与 供 能 ， 血 尿 素 氮 变 化 不 明 显 ， 较 大 负 荷 运 动 后 ， 血 尿 素 氮才 明 显 增 加 ， 且 蛋 白 质 分 解 代 谢 加 强 不 仅 发 生 在 不 适应 的 运 动 时 ， 还 会 延 续 到 运 动 后 的 休 息 期 ， 血 中 尿 素氮 可 在 运 动 后 较 长 时 间 持 续 升 高 。 141因 此 ， 试 验 选 择较大 负 荷 的 运 动 时 间 -游 泳 90 min在 该 负 荷 下 运 动所 产 生 的 尿 素 氮 与 安 静 时 比 ， 差 异 有 显 著 性 。 选 择合 适 的 温 度 30 C，该 温 度 下 小 鼠 能 游 完 规 定 的 时 间 而 不 致 死 亡 。 游 泳 后 休 息 60 min采 血 ， 此 时 血 尿 素 氮 水 平 较 高 。 该 试 验 的 影 响 因 素 相 对 较 少 ， 主 要 有 ：运 动 强 度 和 显 色 反 应 的 温 度 与 时 间 。 各 次 试 验 结 果 虽 有 差 异 ， 但 相 对 稳 定 （ 见 表 6)表 6不 同 日 期 测 得 的 小 鼠 血 清 尿 素 氮 水 平 mg/ dL日 期 96 7 15 8 21 9 6 9 23 11 25 12 9动 物 数 15 14 11 15 12 14血 清 尿 素 氮 I 士 SD 49 9士 12 0 42 4士 3 8 43 5 士 8 1 41 7 士 7 8 36 1 士 4 2 42 2 士 83.4血 乳 酸 测 定理 论 上 ， 只 有 短 时 剧 烈 运 动 ， 乳 酸 产 生 量 才 增 加 ， 而 马 拉 松 ”式 的 运 动 并 不 能 使 血 乳 酸 水 平 升 高 。 161因 此 试 验 应 选 择 短 时 间 剧 烈 运 动 。 运 动 时 产 生 的 肌 乳 酸 可 以 很 快 进 入 血 液 ， 因 此 测 定 运 动 前 和 运 动 后 不同 时 间 的 血 乳 酸 可 以 计 算 乳 酸 的 产 生 和 恢 复 速 度 。我 们 比 较 了 水 温 30 C下 ， 不 负 重 游 泳 90min和 负 重 4%游 泳 10min、 15min三 种 情 况 下 的 血 乳 酸 水平 。 结 果 表 明 ： 负 重 短 时 间 游 泳 ， 血 乳 酸 升 高 明 显； 不 负 重 长 时 间 游 泳 ， 血 乳 酸 升 高 不 明 显 。 见 表 7试 验 结 果 与 理 论 一 致 。 故 我 们 采 用 负 重 4%游 泳 10 min 这 一 方 案 。运 动 后 立 即 采 血 测 得 的 血 乳 酸 值 ， 与 运 动 前 血 乳 酸 值 之 差 ， 可 以 反 映 血 乳 酸 升 高 速 度 ， 与 运 动 后 休息 15min或 60 min测 得 的 血 乳 酸 值 之 差 ， 可 反 映 血 乳 酸 消 除 速 度 。 用 不 同 方 案 进 行 试 验 ， 测 得 的 血 乳 酸值保 健 食 品 抗 疲 劳 作 用 试 验 方 法 研 宄 何 来 英 严 卫 星 楼 密 密 等5见 表 7从 表 7可 见 不 负 重 游 泳 90 min这 一 方 法 ， 在 运 动 后 测 得 的 血 乳 酸 值 均 低 于 运 动 前 的 血 乳 酸 水 平 ， 理 论 上 是 不 成 立 的 ， 出 现 这 一 结 果 的 主 要 原 因 是 ： （ 1) “马 拉 松 ”式 的 运 动 血 乳 酸 升 高 不 明 显 ， （ 2)游 泳 90 min时 间 太 长 ， 小 鼠 可 能 喝 了 较 多 的 水 使 血 液 稀 释 而降 低 了 游 泳 后 的 血 乳 酸 浓 度 。 相 比 之 下 ， 负 重 4%游 泳 10min这 一 方 法 ， 血 乳 酸 产 生 速 度 快 。 小 鼠 喝 水 的 机 会 也 少 得 多 ， 可 见 ， 后 一 方 法 测 得 的 结 果 较 为理 想 .此 表 还 可 看 出 ， 运 动 后 立 即 采 样 ， 测 得 的 血 乳 酸 值 最 高 ， 与 有 的 文 献 报 道 的 运 动 后 15min出 现 血 乳 酸 峰 值 不 同 J7表 7不 同 情 况 下 血 乳 酸 水 平 mmol/L游 泳 条 件日 期不 负 重 90 min96. 9. 6负 重 4% 10 min96 .12 .17负 重 4% 15 min96 11 28动 物 数 11 11 12运 动 前 4.34 士 1.78 3.71 士 0.52 3 02士 0 74游 泳 后 立 即 （ 0min) 3.00 士 1.60 6 .49 士 1 .98 6.00 士 1. 10游 泳 后 休 息 （ 15min) 2.46 士 1.22 4 03 士 1 22游 泳 后 休 息 （ 60 min) 1 .62 士 0 .89 2. 18 士 0.64 2 15 士 1 06影 响 血 乳 酸 测 定 结 果 的 因 素 运 动 强 度 、 运 动 时 间 、 采 血 时 毛 上 的 水 分 是 否 擦 干 （ 有 水 分 时 血 液 被稀 释 ， 血 乳 酸 浓 度 下 降 )、 加 入 破 膜 液 后 是 否 充 分 混 匀 (有 凝 块 时 测 定 值 低 于 实 际 值 ） 等 。乳 酸 测 定 仪 法 快 速 、 简 便 、 灵 敏 、 稳 定 可 靠 。 没 有 乳 酸 测 定 仪 的 实 验 室 ， 可 用 其 它 方 法 测 定 ， 如 ： 改良 Barker Suimmerson 氏 法 、 改 良 一 Mac Queen 氏 法 、 紫 外 分 光 酶 法 、 改 良 酶 电 极 法 等 。 详 见 文 献 。 14但 以 我们 所 用 的 乳 酸 测 定 仪 法 最 为 简 便 、 灵 敏 可 靠 。综 合 以 上 各 项 试 验 可 见 ， 因 影 响 因 素 较 多 ， 试 验 时 每 一 试 样 的 各 项 试 验 都 必 须 设 有 对 照 组 ， 而 不 能 与 “正 常 值 ”或 某 一 次 试 验 中 对 照 组 的 结 果 进 行 比 较 。 并 且 ， 不 能 凭 单 项 试 验 结 果 下 结 论 ， 需 综 合 考 虑 才 能 判 定 所 试 试 样 是 否 有 抗 疲 劳 作 用 。我 们 用 所 建 方 法 对 10个 产 品 进 行 了 检 测 ， 其 中 4个 有 抗 疲 劳 作 用 .结 果 见 表 8。表 8不 同 试 样 抗 疲 劳 作 用 检 测 结 果试 样 号 游 泳 时 间 肝 糖 原 血 尿 素 氮 血 乳 酸 升 高 速 度 血 乳 酸 消 除 速 度 综 合 判 定1 无 效2 无 效3 无 效4 无 效5 个 个 I 有 效6 个 无 效7 个 I I 有 效8 个 个 I 个 有 效9 无 效10 个 I 个 有 效注 ： 一 差 异 无 显 著 性个 与 对 照 组 比 ， 延 长 或 升 高 。 游 泳 时 间 、 肝 糖 原 和 乳 酸 消 除 速 度 t为 阳 性 。i与 对 照 组 比 ， 降 低 。 血 尿 素 氮 和 血 乳 酸 升 高 速 度 I为 阳 性 。 下 接 第 24页 6 中 国 食 品 卫 生 杂 志 第 9卷 第 4期为 灵 芝 有 扶 正 固 本 作 用 的 理 论 。灵 芝 水 提 取 液 的 毒 性 极 低 ， 以 50 g/kg BW (相 当 于 生 药 ） 的 剂 量 连 续 灌 胃 10 d未 见 小 鼠 死 亡 ， 其 LD50 50g/ kg BW.高 剂 量 组 小 鼠 活 动 量 减 少 ，说 明 灵 芝 有 一 定 的 镇 静 作 用 。适 量 的 灵 芝 还 能 促 进 小 鼠 生 长 。本 文 仅 为 灵 芝 水 提 取 液 的 实 验 结 果 ， 而 且 有 作 用 齐 IJ量 （ 生 药 2 50g/ kg BW)比 较 大 ， 故 需 要 进 一 步 研 宄 水 提 取 液 中 的 有 效 成 份 ， 以 应 用 于 实 际 。4参 考 文 献1高 斌 ， 杨 贵 贞 .树 舌 多 糖 的 免 疫 调 节 效 应 及 其 抑 瘤 作 用 .中 国 免 疫 学 杂 志 ，1 989 5(6)363 2何 来 英 ， 等 .灵 芝 的 抗 突 变 作 用 .中 国 食 品 卫 生 杂 志 ， 1994 6(2) 13 Richard T Smith et al The stimulatory effect of bearingprimeiy methylacho lanthrene induced tumours upon the murinelymphoreticularsystem. Int J Cancer. 1973，12: 5774 Smith, Konda Effects of tumour bearing on T and B cell function of mice. Amer J Path. 1972； 66 785 Konda S et al. Stimulatory effect of tumour bearing upon the T and B cell subpopulation of the mouse spleen. Cancer Res. 1973, 33:22476顾 立 刚 ， 等 .薄 盖 灵 芝 对 小 鼠 体 内 、 外 免 疫 反 应 的 实 验 研 究 .上 海 免 疫 学 杂 志 ，1 989, 9(3) 1457 Shin Hea et al. Studies on constituents of the higher fungi of Korea Part XL III studies on inorganic composition and immunepentiating activity of Ganoderma Lucidum in Korea shin. (Korea) CA, 1986 105, 19874k8许 津 ， 等 .灵 芝 对 小 鼠 免 疫 细 胞 的 作 用 .中 国 医 学 科 学 院 学 报 ，1 985; 7(4) 301上 接 第 6页 表 中 无 标 记 者 ， 表 示 未 进 行 试 验 。 1 3号 试 样进 行 了 两 次 游 泳 试 验 ， 结 果 均 为 阴 性 ， 故 未 继 续 进 行其 它 试 验 。 从 表 8可 见 有 抗 疲 劳 作 用 的 产 品 分 别 是 5、 7、 8、 10号 产 品 。4结 论经 过 反 复 验 证 和 对 产 品 功 效 的 检 测 ， 证 明 所 建 方 法 稳 定 、 可 靠 ， 操 作 简 便 ， 能 真 实 地 检 测 出 产 品 的 实际 功 效 。 并 且 ， 除 乳 酸 测 定 仪 外 ， 无 需 特 殊 的 仪 器 设 备， 可 操 作 性 强 ， 一 般 实 验 室 都 能 开 展 实 验 。 可 以 作 为 抗 疲 劳 作 用 的 常 规 检 测 方 法 推 广 应 用 。5 参 考 文 献1冯 炜 权 .运 动 性 疲 劳 和 疲 劳 恢 复 过 程 研 究 的 新 进 展 .中 国运 动 医 学 杂 志 ，1 993, 12(3) 161 2浦 钧 宗 ， 等 .“多 耐 ”运 动 保 健 饮 料 对 动 物 和 人 体 的 影 响 .中 国 运 动 医 学 杂 志 ，1 992 11(4)208 3 Nicholas V Carroll et al. The determination of glycogen in liver and muscle by use of anthrone reagent Biochem J19564浦 钧 宗 ， 等 .优 秀 运 动 员 机 能 评 定 手 册 国 家 体 委 体 育 科 学 技 术 成 果 专 辑 .北 京 ： 人 民 体 育 出 版 社 1989 5朱 忠 勇 .实 用 医 学 检 验 学 .北 京 ： 人 民 军 医 出 版 社 ， 1992 6冯 炜 权 .运 动 性 疲 劳 和 疲 劳 恢 复 过 程 几 个 理 论 研 究 概 况 和 应 用 .体 育 科 学 ， 1992 12(3)53 7金 宗 镰 ,等 .功 能 食 品 评 价 原 理 及 方 法 .北 京 ： 北 京 大 学 出 版 社 ， 19958 Vies J VD. Two methods for the determination of glycogen in liver. Biochem J 1954 57: 41024 中 国 食 品 卫 生 杂 志 第 9卷 第 4期ABSTRACTSStudy on the test methods for the health food assessment on anti fatigue effects. /He Laiying Yan Weixing Lou Mimi et al/ Chinese Journal of Food Hygiene. 1997, 9(4): 1 6 The suit experimental methods for the assessment of function food were established， including: swimming experiment，live glycogen serum urea nitrogen (SUN) and blood lactate concentration test. All above methods have been verified repeatedly to be stabile reliable and the actual effects of function foods can be examined. It is easy to operate and the special instruments are not needed except the instrument for lactate de