病原体分子诊断技术进展PPT课件

病原体分子诊断技术进展 1 分子诊断概念和特点 概念：利用标本中的 核酸 作为检测对象，对感染性 疾病、肿瘤、遗传性疾病等进行诊断和预后判断的 方法。 特点 特异性高、灵敏度高 稳定性高 诊断范围广、适应性强 临床应用前景好 2 什么是核酸？ 链状分子 DNA (脱氧核糖核酸 ) 贮存遗传信息 RNA (核糖核酸 ) 传递遗传信息 遗传信息的传递途径 DNA RNA 蛋白质 转录逆转录 3 DNA 和 RNA 的区别 糖基 + Base Nucleoside + Phosphate P Nucleotide A、 DNA和 RNA的主要区别就在 骨架上 的糖基。 B、 DNA很稳定， RNA不稳定 。 4 RNA 和 DNA 的结构 dsDNA ssDNA ssRNA 5 通常 RNA在细胞中拷贝数远高于 DNA的拷贝数 一个或几个拷贝 DNA 可达 10000个拷贝的核糖体 RNA (rRNA) One Cell Contains: 6 如使用 rRNA为靶标，将极大地提高了 取样效率和扩增检测灵敏度 A、如果 2ml样本 含有 1个细菌 取 0.2ml样本， 最终得到细菌 的几率是 1/10 。 Sample Cell LysisTarget RNA Released B、 如果 2ml样本含有 1 个细菌 先裂解，后取样， 2ml样本含有 10000个 rRNA。 取 0.2ML样本，可得 到 1000个分子 7 主要的核酸扩增技术 DNA扩增技术 A、 PCR：使用 Taq酶进行扩增，温度循环； RT-PCR将 RNA变 成 DNA，再进行 DNA扩增 B、实时荧光 PCR：扩增与 PCR相同，采用 实时闭管荧光检测 （分子信标， Taqman探针等） RNA扩增技术 A、 TMA：恒温扩增，使用 RT酶和 T7酶；终点杂交保护检测 B、 SAT：扩增与 TMA相同， 采用实时闭管荧光检测 （分子信 标） 8 实时闭管荧光检测常见技术 9 PCR原理 10 Real-Time PCR 11 TMA原理 12 SAT 原理（实时荧光 TMA） 13 SAT与 PCR技术原理比较 RT RNA cDNA RT 1000 copies T7 SAT DNA Taq Taq PCR 30分钟内 扩增 1010倍 14 DNA扩增技术（ PCR）用于病原体 检验的不足 不能区分 “活菌 ”“死菌 ” 与临床相关性差 不能区分 “潜伏感染 ”“活动性感染 ” 临床意义小，如 CMV 交叉污染 变温检测，对仪器要求高 反应易受抑制 15 RNA扩增技术用于病原体 检验的优势 可以区分 “死菌 ”“活菌 ”：病原体死亡， RNA很快降解 与临床相关性好（培养），减少无效治疗，比如抗 生素滥用 可以诊断 “活动性感染 ” 活动性感染：指示 RNA转录活跃 潜伏感染：指示 RNA不转录 不易污染：靶标和扩增产物都是 RNA 灵敏度高： RNA 拷贝数 DNA拷贝数 16 RNA诊断产品的商品化程度及应用 FDA或 CE 认证产品 （ TMA） SFDA 认证 产品 （ SAT） 沙眼衣原体（ CT）核酸检测试剂盒（ RNA恒温扩增） 淋病奈瑟菌（ NG）核酸检测试剂盒（ RNA恒温扩增） 解脲脲原体（ UU）核酸检测试剂盒（ RNA恒温扩增） 结核分子杆菌（ TB）核酸检测试剂盒（ RNA恒温扩增） 为什么我们必须熟悉和了解 RNA扩增技术？（一） 17 为什么我们必须熟悉和了解 RNA扩增技术？（二） 血液筛查市场 美国 中国 RNA诊断 RNA诊断 传统技术 传统技术 其他传染病市场（优生优育： CT/NG为例） RNA诊断 传统技术 传统技术 美国 中国 100%进口！ 有部分国产 18 RNA 用于 TB的检测（ TMA）进入多国诊疗指南 1996：美国 CDC首个 NAAT技术在 TB实验室诊断的应用的指南 TMA通 过 FDA认证，配合培养法对涂阳患者进行诊断 2000：美国 CDC更新 NAAT法在 TB实验室诊断中应用的指南 TMA用于 TB疑似患者 (涂阳、涂阴 )痰液检测、 PCR用于 TB涂阳患者的痰液检测 2007：加拿大卫生部 TB诊断标准 为什么我们必须熟悉和了解 RNA扩增技术？（三） 19 什么样的病原体需要分子诊断？ 传统方法不能及时检测或鉴定的病原体。 难培养的 如 CT、 MG、手足口病毒 培养较慢的 如 TB 镜检容易弄错的 如 NG、 T.vaginalis 免疫交叉反应较多的 如 CT 需要分型的 如 HPV、 HSV 胞内病原体 如衣原体、支原体、病毒 20 与 PCR、 TMA等相比， SAT改进了捕获方法（一） 靶标核酸 捕获核酸 磁珠 Oligo dT Oligo dA 优点： 几乎去除了所有抑制剂 允许使用大体积样本 可同时处理多种样本 21 与 PCR、 TMA等相比， SAT开发了全自动样本处理方法（二） 全自动样本处理工作站 特点 不需要任何样本前处理 国内唯一全自动尿样（血样等 ）处理系统 1.5小时， 96个样本 （ RD Mag -96） 样本 提取 反应液制备 一体化 22 SAT应用例一（ CT/NG尿液检测，国内唯一 ） CT/NG 尿液检测 CT 女性感染人群中 70%以上 无临床症状 男性感染人群中 50%无临床症状 NG 女性感染人群中 60%无临床症状 男性感染人群中 20%无临床症状 CT的反复感染不仅导致不育，而且 增加感染淋球菌、 HIV、 HBV等风险（ 6 8倍） 【 1】 【 1】 李跃进 ,谭湘芳 .荧光定量 PCR检测性病的结果分析 J.实用医技杂志 ,2007,14(16):2151. 23 RNA（ TMA）检测尿液中的 CT（美国） 尿液样本的灵敏度、特异性与拭子相当 Systematic Review: Noninvasive Testing for Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. Ann Intern Med.2005;142:914-925. 24 SAT国内数据 检测样本量： 1050例 CT-SAT 拭子 尿液 NG-SAT 拭子 尿液 CT感染拭子和尿液灵敏度对比 NG感染拭子和尿液灵敏度对比 25 SAT应用例二（结核分枝杆菌检测） 操作流程 痰液预处 理 超声波处理 15min 预热 15min 恒温扩增 40min 耗时 2小时 26 1、以临床诊断的结果为金标准，对 253例结核患者痰标本； 134例其他呼吸道感染患者标 本同时进行涂片、 TB-SAT、 Bactec MGIT 960检测。 参数 方法 临床诊断 灵敏度 (%) 特异度 (%) 阳性预测值 (%) 阴性预测值 (%)阳性 阴性 TB-SAT 总样 本 阳性 171 0 67.6 100 100 62.0 阴性 82 134 涂片 阳性 阳性 120 0 97.6 100 100 40.0 阴性 3 2 涂片 阴性 阳性 51 0 39.2 100 100 62.6 阴性 79 132 MGIT 960+菌种 鉴定 总样 本 阳性 156 0 61.7 100 100 58.0 阴性 97 134 涂片 阳性 阳性 118 0 95.9 100 100 28.6 阴性 5 2 涂片 阴性 阳性 38 0 30.2 100 100 60.0 阴性 88 132 SAT检测痰液标本中的结核杆菌 27 28 其他科研临床检验血液筛查 传染病 癌症检测遗传检测 nHIV nHCV nHBV nSyphilis 细菌支原体 nCT nNG nUU nTB nMG nMP 病毒检测 nHIV nHCV nHBV nHPV nEV/EV71/CA16 nFlu A/ H1N1 nHCMV n 前列腺癌 n 直肠癌 n 乳腺癌 n 巨细胞瘤 n 其它肿瘤 n 工业界 n 学术研究用 n 食品安全 n 水污染检测