表观遗传学与肿瘤PPT课件

表观遗传学与肿瘤 1 表观遗传学概念 表观遗传学是研究不涉及 DNA序列变化、可遗传的基因表 达调控方式的学科； 一般来说 , 细胞的基因组中除了 DNA和 RNA序列以外还有很 多调控基因表达的信息 , 虽然它们本身不会改变基因的序 列 , 但是可以通过对 DNA的修饰、蛋白质与蛋白质、 DNA和 其他分子间的作用 , 影响和调节基因的功能 , 并且通过细胞 的分裂和增殖周期影响遗传 , 这些都属于表观遗传学所研 究的范畴。 2 表观遗传概念与机制 表观遗传是指基因表达或蛋白表达改变不涉及基因 DNA序 列的变化、但可随细胞分裂和增殖而稳定遗传的现象。 表观遗传机制对于人体多种细胞的生长和分化都是重要的 ，如 X染色体失活等一些正常细胞生理功能都由表观遗传 所决定。 随着年龄的增长或环境的影响，细胞正常的表观遗传状态 可能被打破，从而导致促癌基因的异常活化或抑癌基因的 失活、促进肿瘤形成。 表观遗传修饰主要包括 DNA及一些与 DNA密切相关的蛋白 质的化学修饰，某些非编码的 RNA也在表观遗传修饰中起 重要作用；因此表观遗传修饰可从 DNA、 组蛋白、染色质 及 RNA等多个层面上调控基因的表达。 常见表观遗传修饰机制包括：基因组印记、 DNA甲基化、 组蛋白修饰和非编码 RNA、染色质重塑 3 一、 DNA甲基化与肿瘤 在早期发育阶段，甲基化和非甲基化交替 是细胞得以生长和分化的关键程序， 有保证细胞正常发育和基因组稳定性的重要作用 在正常细胞内，启动子区的胞嘧啶磷酸鸟嘌呤 (CpG)呈非 甲基化状态，而大多数散在分布的 CpG二核苷酸常多发生 甲基化。 DNA甲基化一般与基因的沉默有关，非甲基化则与基因的 活化相关，去甲基化往往与沉默基因的重新激活有关。 4 正常的甲基化对于维持机体的功能是必需的，如基因印记 、 X染色体失活、细胞分化、胚胎发育等；而异常的 DNA 甲基化则会引起疾病甚至肿瘤的发生，异常 CpG的重新甲 基化通常被认为是人类癌症发生的早期特征 人类肿瘤细胞株中，许多肿瘤相关基因 5端启动子区 CpG 岛发生高甲基化，如某些抑癌基因、细胞周期调节基因、 肿瘤转移抑制基因、 DNA修复基因及血管生成抑制基因。 有些在不同的癌症中高甲基化，有些只在特定的癌症中甲 基化； 恶性肿瘤的另一个特点是重复序列如卫星 DNA和寄生 DNA 的甲基化程度降低，低甲基化的基因组不稳定、易突变； 在许多癌症中，细胞整体呈现低甲基化水平，并随着肿瘤 进展，低甲基化水平加强；基因整体甲基化水平降低可增 加某些基因表达，如 ras、 myc等原癌基因活化，形成突变 热点、转座子异常表达、基因不稳定等，促进肿瘤发生 5 Paz等对人类 12种肿瘤 70多个肿瘤细胞系进行了 15个基因 的系统分析： 每种肿瘤至少有 1种基因启动子区发生高甲基化； 这种启动子甲基化具有肿瘤类型的特异性； 结直肠癌 DNA错配修复基因 (hMLH1)、 O6-甲基鸟嘌呤 DNA甲基转移酶 (O6-MGMT)、金属蛋白酶组织抑制剂 3(TIMP) 乳腺癌 仅 O6-MGMT基因高甲基化 信号途径关键位置基因异常甲基化可导致该途径的异常激 活或抑制 Wnt途径中的 Wnt抑制因子 -1(WIF-1)基因，编码蛋白与 Wnt配体竞争卷曲蛋白受体的结合、阻断 Wnt信号，为 该途径的负反馈调节基因，该基因的异常高甲基化与 鼻咽癌、膀胱癌、食管癌等多种肿瘤的发生有关 6 基因的 CpG位点是自发突变的重要位点，人类肿瘤 P53基因 突变 25%发生于该位点，结直肠癌者达 50% 7 DNA甲基化与早期诊断：可以检测体液中某些基因的异常 甲基化状态，为肿瘤的早期诊断。 如检测肺癌患者痰液中 P16甲基化状态作为肺癌辅助诊 断手段 检测粪便中分泌型卷曲相关蛋白 2基因甲基化状态诊断 结直肠癌 DNA甲基化与肿瘤发展及预后 结肠腺瘤性息肉病基因 (APC)启动子甲基化可预示宫颈 癌转移和复发、并提示患者处于高危状态 肝癌细胞钙粘蛋白基因甲基化与血管浸润及肿瘤转移 有关 基因异常甲基化还可与染色体缺失协同抑制基因表达 ，并且有互作效应 8 卷曲同系物 9(FZD9)基因非甲基化、该位点染色体不发生缺 失的骨髓增生异常综合征转化的急性髓系白血病患者 的 1 年总生存率约为 90%；基因甲基化、且该位点染色体不发 生缺失的患者 1年总生存率约为 75%；基因非甲基化且该位 点染色体发生缺失的患者 1年总生存率达 40%左右，而基因 甲基化、且该位点染色体发生缺失的患者 1年总生存率仅 15%左右 。 9 组蛋白修饰与肿瘤 染色质通常由 DNA、 组蛋白、非组蛋白及少量 RNA组成， 组蛋白是染色质的基本结构蛋白； 组蛋白的 N-末端可通过甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化 等翻译后修饰，改变 DNA与组蛋白之间的相互作用，影响 染色质的松散与集缩，从而激活或抑制转录，其中以组蛋 白甲基化、乙酰化尤为重要； 组蛋白乙酰化是由组蛋白乙酰基转移酶 (HAT)和组蛋白去 乙酰基酶 (HDAC)协调催化完成； 修饰的部位一般位于 N-末端的赖氨酸残基，如 H3上的 9号 和 14号、 H4上的 5、 8、 12、 16号； 10 组蛋白乙酰化是一个可逆的动力学过程，可以调节基因的 转录； 组蛋白的末端赖氨酸残基高乙酰化与染色质松散及转录激 活有关，低乙酰化与基因沉默或抑制有关。组蛋白乙酰基 转移酶催化组蛋白尾部的赖氨酸残基乙酰化，导致局部 DNA与组蛋白八聚体的紧密缠绕被解开，使各种转录因子 能与 DNA调控元件相结合，促使基因发生转录； 组蛋白去乙酰化酶异常结合到启动子区，从而抑制正常功 能基因的转录也可能是恶性肿瘤发生的机制之一 11 组蛋白甲基化 甲基化位点多位于组蛋白 H3、 H4的赖氨酸或精氨酸残基， 由组蛋白赖氨酸甲基转移酶催化 ，而去甲基化由赖氨酸去 甲基酶催化； 赖氨酸可单、双、三甲基化，精氨酸可单、双甲基化，增 加了组蛋白修饰的复杂性 通过组蛋白甲基化的位置，可判断基因是被激活还是抑制 H3-K9和 H4-K20甲基化与基因沉默有关； H3-K4、 K36、 K79 甲基化可使基因激活 组蛋白修饰能够引起核小体结构的变化 , 导致染色质重塑 , 影响各类转录因子与 DNA的结合 , 进而影响基因的转录。 组蛋白乙酰化对于维持组蛋白的功能和 DNA转录是必需的 , 组蛋白乙酰化的失衡将引起相应的染色体结构和基因转录 水平的改变，影响细胞周期、分化及凋亡 , 并可导致肿瘤 的发生 12 染色质重塑： 指染色质位置、结构的变化，包括紧缩的染色质丝在与核 小体连接处发生松动，造成染色质的解压缩，从而暴露基 因转录启动子区中的顺式作用元件，为反式作用因子与之 结合提供可能。 两类结构介导： ATP依赖的核小体重塑复合体，通过水解 作用改变核小体构型；组蛋白共价修饰复合体，催化对核 心组蛋白 N-末端尾部进行共价修饰，改变核小体构型，为 其它蛋白提供与 DNA作用的结合位点； 动态的染色质重塑是大多数以 DNA为模板的生物学过程的 基础，如基因转录、 DNA的复制与修复、染色体浓缩与分 离、细胞调亡等，因而异常的染色质重塑与肿瘤的发生与 发展直接有关 不同的染色质重塑可导致不同的肿瘤，但其与肿瘤发生与 发展的关系尚有待进一步探索 13 非编码 RNA调控 非编码 RNA分为长链非编码 RNA和短链非编码 RNA。 长链非 编码 RNA在基因簇甚至整个染色体水平发挥顺式调节作用 ；短链 RNA在基因组水平对基因表达发挥调控作用。 短链 RNA能介导 mRNA降解、诱导染色质的结构的改变从而 决定细胞的分化命运、对外源核酸序列有降解作用以保护 本身的基因组，常见的短链 RNA有小干涉 RNA(Short interfering RNA， SiRNA)和微小 RNA(MicroRNA, miRNA)。 干扰 RNA： 与真核生物 mRNA编码区同源的外源性双链 RNA (dsRNA)能特异性地诱导其同源 mRNA的降解，导致相应基 因的沉默， hx 现象称为 RNA干扰 (RNA i)， RNA i依赖于小干 扰 RNA与靶序列之间严格的碱基配对，有很强的特异性； 微小 RNA： 由核内的 Pri-miRNA在 Rnase 核酸酶作用下加 工成发夹状 pre-miRNA，转运到胞质后在双链 RNA特异性 RNA内切酶 (Dicer)作用下被切割成双链 miRNA。 解链成单链 后进入核糖蛋白复合体，参与对 mRNA的切割或翻译抑制。 14 RNA干扰分为两个阶段： 酶切启动阶段：外源双源 RNA(dsRNA)通过外源导入、转基 因、或者病毒感染等方式进入细胞后，专一性的双链 RNA 内切酶识别 dsRNA并将其切成大量的碎片 (siRNA)， 能识别 同源的靶 mRNA序列，启动 RNA干扰； RISC形成： siRNA与特异性蛋白结合后解链，其反义链与核 酶复合物结合，形成诱导 RNA沉默的复合物 (RNA induced silencing complex, RISC)。 RISC形成后结合到靶 mRNA上，在 RNA依赖的 RNA聚合酶催化下形成 dsRNA，后者又会在双链 RNA内切酶作用下降解为 siRNA。 siRNA天然的作用是封闭转座子，它们能在染色质水平、 转录水平、转录后水平、基因水平对基因表达进行调控。 实验室研究表明，部分 miRNA与多种肿瘤、癌症的发生密 切有关。 15 不同表观遗传修饰之间的相互调控： 表观遗传修饰能从多个水平上调控基因的表达，而不同水 平的调控之间又相互关联，在真核细胞内形成了一个完整 的表观遗传调控的网络。 miRNA的表达受甲基化及其它表观遗传机制的调控； siRNA可诱导 DNA甲基化 16 肿瘤细胞表观遗传学异常的分子机制 印记丢失： 遗传印记是指，来自父母双方的等位基因在通过精子和卵 子遗传给子代时发生了修饰，使带有亲代印记的等位基因 具有不同的表达特征。 正常的基因印记受 DNA甲基化和组蛋白甲基化及乙酰化的 调控，以保证父系基因的决定地位，即一对等位基因中一 个发生转录，另一个被抑制。 肿瘤中一些基因丢失其遗传印记会导致异常情况发生，如 等位基因的共表达。如： 胚胎细胞只有母系染色体时成为畸胎瘤、只有父系染色体时成为 葡萄胎； 结肠癌患者结肠上皮类胰岛素生长因子 2(IGF2)等位基因共表达， 致强效生长刺激，与不断升高的结肠癌风险有关； 而在 Wilms瘤， IGF2基因印记丢失，产生一种异常的未分化细胞， 其不断增生而不受调控及修复基因的影响，最终引发肾癌； 17 基因印记丢失的小鼠模型： Holm等通过破坏 DNA甲基转移酶 DNMT1， 暂时诱导基因组 脱甲基化，从而建立基因印记丢失的小鼠模型。 来自该模型的成纤维细胞可在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤 ，并具有体外永生的特性。 Holm认为，单独的印记丢失就可使细胞发生癌性增生。因 为细胞降低了永生化的域值，在没有基因突变的情况下， 可遗传的基因表达模式的变化导致干细胞的异常增生，进 而诱发肿瘤的发生、发展。 18 DNA甲基化 肿瘤的表观遗传学异常以 DNA甲基化的模式改变为主，包 括整个基因组的低甲基化和启动子区的高甲基化； 目前最受关注的是启动子区 CpG岛的高甲基化导致抑癌基 因的转录沉默，这很可能是癌性增生的最初表现； Issa等研究证实存在 CpG岛甲基化表型，即同时存在多个基 因具有肿瘤特异性 CpG岛甲基化。 常见的抑癌基因 P16就是因为启动子区 CpG岛高甲基化而沉 默的，该基因功能的丢失可延长干细胞的寿命、导致基因 组不稳定性、早期癌性病变易于发生。 与肿瘤异常甲基化状态相关的酶是 DNA甲基转移酶 (DNMTs)， 其催化在 CpG岛胞嘧啶 5位上共价连接上甲基基 团。 19 DNMT酶包括 DNMT1、 DNMT3b和 DNMT3a， DNMT1与甲基 化维持有关，即在半甲基化 DNA中以甲基化单链为模板对 互补链进行甲基化； DNMT3b和 DNMT3a介导 DNA双链的从 头甲基化。 多种组织来源的肿瘤细胞可 DNMT蛋白及活动水平增高， DNMT抑制剂抑制 DNMT活性可延缓小鼠肺癌模型中的癌性 增生。 实验研究发现基因敲除 DNMT1后，肿瘤总体甲基化水平仅 微弱减少，而敲除 DNMT3b可使 95%的基因组 5-甲基胞嘧啶 去甲基化、全部启动子去甲基化、沉默基因活化表达。说 明 DNMT1的功能以维持甲基化及基因表达抑制为主，而 DNMT3具有从头甲基化作用。 尽管 DNMT1对于未甲基化的物质几乎无甲基化作用，但其 过度表达依然可导致未甲基化的人类 CpG岛序列从头甲基 化，因此，其在肿瘤细胞很可能具有上述能力。 20 组蛋白修饰与染色质重塑： 核小体是染色质高级构造的基本结构，组蛋白是核小体的 重要组成部分，核小体由 147对碱基包裹 8个组蛋白构成的 核心蛋白构成， 147对碱基的位置和组蛋白的修饰对于维 持基因的表达模式及染色体结构具有重要作用，以此来调 控基因的表观遗传。 核小体的各组分处于精细的稳定状态，任何外界的微小变 化可能对细胞表型及转录模式产生巨大的影响 对于染色质包装来说，组蛋白修饰与 DNA甲基化之间有密 切的联系，各种选择型去乙酰化酶、 DNMTs复合体、特定 甲基化 CpG序列结合蛋白家族 (MBDs)之间相互联系。在调 控基因转录时甲基化和赖氨酸乙酰化之间相互协作，但甲 基化起主导作用； MBDs具有特异性结合基因启动子的能 力，和 DNA高甲基化及肿瘤中沉默基因有关 21 组蛋白乙酞基转移酶 (HATs)和组蛋白去乙酞化酶 (HDACs)相 互作用调节组蛋白乙酞化的平衡，同时组蛋白甲基转移酶 (HMTs)和组蛋白去甲基化酶有效的调控着组蛋白甲基化； 组蛋白赖氨酸乙酞化与转录激活相关联，而这些残基的甲 基化则同时与激活以及抑制状态有关； 组蛋白乙酞化和甲基化模式通过不同的效应蛋白而体现， 含有 bromo结构域的蛋白质，可以识别乙酞化的赖氨酸残 基；含 chromo结构域，可以结合到甲基化的赖氨酸残基上 ，作用于组蛋白并引起基因转录。 赖氨酸甲基化有单甲基化，双甲基化以及三甲基化 3种不 同的形式，他们显著扩大了组蛋白复合体的密码信息。比 如， H3K9乙酰化和 H3K4 甲基化是表达的活跃标志 ; 而 H3K9 和 H3K27的单、双和三甲基化的大量出现则是转录抑制相 关的组蛋白甲基化的标志。 22 早期肿瘤表观遗传学改变调控的潜在网络 表观遗传学改变在干细胞的异常克隆性增殖及肿瘤的易感 性方面发挥关键作用 对慢性炎症导致肿瘤的研究发现，正常细胞对细胞应激和 损伤的应答是暂时的，抑制细胞的存活，而慢性暴露于应 激状态下则引起上述应答反应异常延长从而可能导致异常 的克隆增生。 上述异常应答反应涉及 SIRT1的异常增加、抑癌基因 p53的 转录抑制、 HIC1的沉默： SIRT1是一种多功能应激蛋白，组蛋白去乙酰化酶 的一种 ，参与 p53基因的翻译后修饰、从而下调 p53转录活性； HIC1基因是锌指结构域成员，既是 p53的激活目标，又与 SIRT1组成复合体并向 SIRT1启动子聚集、抑制其转录； 23 SIRT1的去乙酰化作用还可导致并维持配对基因的转录沉默 ，诱导降低 SIRT1的活性可以使这些沉默基因重新表达，这 一过程涉及到 Wnt发育信号通路； Wnt发育信号通路对成人细胞更新时干细胞的扩增及维持 有重要作用； 在结肠癌时，由于对抗 Wnt信号途径的 SFRPs基因家族首先 发生了沉默，随后当下游通路基因突变时，由于拮抗因素 ，使 Wnt通路过度激活，从而促进肿瘤的发展；而肿瘤细 胞实验时，敲除 SIRT1基因可以使已经沉默的 SFRPs基因重 新激活，从而逆转结肠癌及乳腺癌中 Wnt途径的过度激活 ； SIRT1和 PcG复合物在肿瘤中异常的基因沉默维持过程中可 能共同发挥重要作用。 24 HIC1基因的纯合性缺失或表观遗传丢失均可导致 SIR1基因 表达增加，从而降低 p53对正常细胞的作用； HIC1基因的表观遗传沉默也涉及其他路径， HIC1基因沉默 后可导致 Wnt 通路的过度激活。 HIC1结合 TCF-4后可以募集 p-catenin到紧凑的核结构上，构成 HlC1体，就会妨碍驱动 正常的 Wnt通路的正常核 p-catenin-TCF复合体的形成。 25 肿瘤表观遗传学在干细胞及酵母中的研究 过去的观点认为，成熟的干细胞发生异常的克隆性增生， 导致细胞的异质性的不断增强，因此很多肿瘤呈现出一系 列的演进过程； 新的观点强调肿瘤增生是由肿瘤干细胞引起的，肿瘤干细 胞内的一些分子可以促进肿瘤的发展，如特定干细胞的 Oct4的过表达可促进肠及其他器官的上皮细胞的肿瘤迅速 发生。 胚胎干细胞中，细胞干细胞化的转录因子包括： OCT4、 NANOG、 SOX2， 都定位于一个限制性的启动子区域，这 些转录因子、细胞增殖调控基因、组织分化调控基因都普 遍与干细胞的多潜能性相关，大多保持低甲基化状态。 26 细胞干细胞化相关转录基因近侧的启动子 区包含 PcG蛋白及三甲基化 H3K23， 在胚胎 发育中，当基因需要表达时， PcG的影响可 被逆转或消失，到后续的细胞成熟或分化 阶段， PcG复合物的作用可重新发挥，保持 长时间的基因沉默。 PcG蛋白保持一个精确协调的、可塑的基因 表达模式，其诱导的染色体标记在胚胎发 育过程中能够保持干细胞和分化发育细胞 表型之间的平衡 27 表观遗传修饰与肿瘤治疗 与基因突变、基因缺失不同，表观遗传修饰具有可逆性， 因此可在肿瘤或癌前病变中，通过去甲基化或乙酰化的措 施，恢复某些关键基因的表达，达到防治肿瘤的目的。 DNA甲基转移酶 (DNMT)抑