单克隆抗体基础知识PPT课件

单克隆抗体知识 1 抗体是具有 4条多肽链的对称结构，其中 2条较长、相对分子量较大的相同的重 链（ H链）； 2条较短、相对分子量较小的相同的轻链（ L链）。链间由二硫键 和非共价键联结形成一个由 4条多肽链构成的单体分子。轻链有 和 两种，重 链有 、 、 、 和 五种。 整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。在给定的物种中，不同抗体分子 的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。可变区位于 “Y”的两臂末端。 在可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排 列顺序更易发生变异区域称高变区。高变区位于分子表面，最多由 17个氨基酸 残基构成，少则只有 2 3个。高变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原抗原 的特异性。 一个抗体分子上的两个抗原结合部位是相同的，位于两臂末端称抗原结合片段 （ antigen-binding fragment, Fab）。 “Y“的柄部称结晶片段（ crystalline fragment,FC），糖结合在 FC 上。 抗体是指能与相应抗原特异结合的具有免疫活性的球蛋白 抗体的基本知识 2 抗体结构图 抗体是指能与相应抗原特异结合的具有免疫活性的球蛋白 抗体的作用机制：抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应及补体依赖 性细胞溶解作用 3 单克隆抗体的制备方式： 1 传统的单克隆抗体制备方法 2基因工程单克隆抗体制备方法 3未来单克隆抗体的发展方向 4 传统的单抗制备方法 5 单克隆抗体在理论和实践上的应用成为解决生物学和 医学等许多重大问题的重要手段。但是，上述应用的单抗 属于 鼠源性 ， 鼠源性单抗应用于人类 的临床应用结果反映 出了单克隆抗体药物存在的一些问题 : (1) 鼠 源 性单抗容易容易产生 人抗鼠抗体 (HAMA) ,在体内 作为 异源蛋白 被清除掉，从而削弱其治疗的有效性 。 (2) 鼠源性单抗在人体内 生物活性降低， 不能有效地激活 人体的生物效应。 研究背景 因此， 人们一直致力于人源性抗体的研究 。 6 人源化治疗性单克隆抗体的研究进展 构建的基本思路 鼠抗体人源化就是通过 基因改造 ，使其和人体内的抗体 分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避 免诱导 HAMA（人抗鼠抗体）反应。 遵守两个原则 首先，要保持抗体的亲和力和特异性； 其次，要降低或消除抗体的免疫原性。 7 以分子生物学技术提取、扩增编码人抗体的 DNA，构建质粒，建立组合抗体文库，再利用供 者文库建立针对某一特定抗原的子文库。 以该技术制备的 抗体片段 (Fab)是人源抗体 ，具有建库简单、抗体表达稳定等特点。迄今已 有多种抗体产生。可以预见，该技术具有良好的 发展和应用前景。 解决方案： （ 1）用人脾细胞与鼠骨髓瘤细胞杂交； （ 2）用 EB病毒转化人的 B淋巴细胞； （ 3）用基因工程法制备嵌合抗体等。 效果不强 （ 4）最新方法： 抗体库筛选技术和转基因鼠技术 8 单克隆抗体的发展史 第一代：鼠源性单抗 药物特异性很强，副作用大，现在已经渐渐退出市场。 不过由于其代谢比较快，目前在放射性元素标记的单克隆 抗体药物中使用。 第二代：人鼠嵌合性单抗 进行人源化改造，使其人源化程度达到 70%左右。 第三代： CDR移植抗体和 SDR移植抗体 人源化程度达到 95%左右，大大降低了毒副作用。 第四代：全人源化单抗 2002年，的世界首个药物 阿达木单抗上市。人源 化及全人源单克隆抗体由于副作用小，在体内停留时间长 ，更有利于治疗 。 9 鼠源性单克隆抗体：鼠杂交瘤单克隆抗体主要是将来源于免疫接种过的小鼠的 B 细 胞与骨髓瘤细胞融合，继而筛选出既能无限增殖又能分泌抗体的鼠杂交融合细胞， 进而进行筛选、抗体制备和抗体纯化。 嵌合性单克隆抗体：指用人的恒定区取代小鼠的恒定区，保留鼠单抗的可变区序列 ，形成一个人 -鼠杂合的抗体。其研制程序快，可大幅度降低异源抗体的免疫原性， 却几乎保持亲本鼠单抗全部的特异性和亲和力。另外，它还具有人抗体的效应功能 ，如补体固定、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ ADCC）等。 人源化单克隆抗体：利用现有的无数已详细分析过的小鼠抗体，取其与抗原直接接 触的那段抗体片段（互补决定区， CDR）与人的抗体框架嫁接，经亲和力重塑，可 维持其特异性和大部分的亲和力，同时几乎去除免疫原性和毒副作用。 全人源单克隆抗体：其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作 用。全人源抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、 EBV 转化 B 淋巴细胞技术 、噬菌体显示技术（ phage display）、转基因小鼠抗体制备技术（ transgenic mouse）和单个 B细胞抗体制备技术等。 10 11 1.嵌合抗体（ Chimeric antibody) 用人源基因代替鼠源单抗的恒定区，即该单抗由 鼠的可 变区 和 人的恒定区 组成的嵌合抗体。 由于嵌合抗体可变区（ V）约占整个抗体的 30%，鼠源 性抗体 V区中的框架区（ FR)仍残留一定的免疫原性，可 诱导 HAMA反应。 灵长目源抗体也是 一类嵌合抗体，通过免 疫短尾猿猴产生。由于 其抗体的可变区与人可 变区无差异，不至于发 生抗体反应。 缺点 解决方案 鼠源抗体 嵌合抗体 12 2.CDR移植抗体（ CDR grafted antibody) 真正意义上的抗体人源化。抗体中除了 3个 互补决定区 （ CDR）是鼠源的外，其余全部是人源结构，人源化程度可 达到 95%以上，具有更高的安全性和更低的毒性。 不足 有时异基因的 CDR人源化抗体可能引起抗个体基因型 反应。 改良方案 进行 SDR移植改良 嵌合抗体 人源化抗体 3个 CDR 13 3.SDR移植抗体 (SDR grafted antibody) 在 CDR移植抗体的基础上，将异源抗体中与抗原结 合密切相关的 SDR等 少数残基 移植到人抗体相应位置上 ，进一步降低了抗体的异源性。通过这种方法，使人源 化的抗体潜在的免疫原性降至最低。 14 4.全人单克隆抗体（ Fully humaneantibody) 它是将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转 染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单 克隆噬菌体抗体。 在 HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的 优越性。 4.1.抗体库筛选技术 4.1.1.噬菌体表面展示技术 鼠源抗体 完全人源化抗体 15 基本原理和程序 噬菌体抗体库 人免疫细胞基因组 PCR技术扩增 整套 的抗体重链可变区（ VH）和轻链可变区（ VL）基因 噬菌体 DNA中有抗体基因 外壳表面有抗体分子的表达 克隆并以融合蛋白的形式表达 基因重组 噬菌体重组 DNA 构建 利用抗原 -抗体特异性 筛选所需抗体并进行克隆扩增 获得可溶性抗体片段 表达 16 * 局限性 1.在噬菌体展示过程中涉及细菌转化、噬菌体包装、展示 跨膜分泌，这就大大限制了所建库的容量和分子的多样性。 目前，常用的噬菌体展示文库容量在 109。 2.不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为 有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导 致在体内筛选时需要外加选择压力。 3.噬菌体展示文库无法进行有效的体外突变和重组进而限 制了文库中分子遗传的多样性。 4.因为噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以一 些对细胞有毒性的分子（如生物毒素分子 )很难得到有效表 达和展示。 17 4.1.2.核糖体展示技术 基本原理和程序 人免疫细胞基因组 EDTA 体外转录、翻译、偶联 mRNA-核糖体 -蛋白质三聚体 核糖体展示的蛋白文库 构建 基因型和表型联系 利用抗原 -抗体特异性 筛选所需抗体复合体 EDTA解离 获得特异 mRNA RT- PCR RT- PCR 特异抗体 DNA子文库 获得特异性的、高亲和力的抗体 表达 18 * 传统的筛选技术具有本身难以克服的缺陷，主要表 现在构建文库和筛选时都涉及细胞转染、噬菌体包装、 跨膜分泌和蛋白质降解等诸多方面的问题，文库容量及 其分子多样性在某种程度上受到很大的限制，降低了文 库筛选效率。 核糖体展示技术由于在体外无细胞翻译体系中进行 ，用 mRNA的可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富 集，不受细胞转化效率的限制。它 大大的提高了文库容 量和筛选通量（ 1012-1014）而且能够增加表达的蛋白质 的溶解度。 优势 19 4.2.转基因小鼠 通过基因敲除技术，使小鼠自身的基因失活，并导 入新基因，创造出携带人抗体重轻基因簇的转基因小 鼠。这种人抗体基因小鼠所携带的人 DNA片段具有完善 的功能，可以有效地进行同型转换和亲和力成熟。任 何靶抗原均可被用来免疫该小鼠，使其产生高亲和力 的人抗体。 案例 ： 日本麒麟公司用基因工程技术，使小鼠携带完整的 人 14号染色体，该染色体包含全部人抗体产生基因。 但迄今尚无该技术生产的制品问世。 20 4.3.微胞杂交干细胞技术 日本学者 Ishida等首先提出 技术要点： 首先将抗 G418的人成纤维细胞与小鼠的 A9细胞融 合，通过筛选，得到抗 G418的小鼠 A9细胞，再运用 PCR或原位荧光杂交方法筛选，先筛选出的细胞用秋 水仙素处理 48h，然后用细胞松弛素 B处理并高速离心 ，分离出含 2号、 14号、 22号染色体的小鼠 。 人源抗体在这种转基因小鼠的产量还比较低。 21 4.4.其他方法 XTL生物制药公司使用一种类似于人骨髓移植的方法 ，用放射线破坏动物骨髓，然后注入人抗体生成细胞。该 公司已用此法生产出一种全人单抗。 22 * v 近年来 ,人源化抗体和人抗体的出现为临床应 用带来了新的希望 ,当前正处于临床研究的多 种抗体中 , 嵌合抗体和 人 源 化 抗 体 所 占 比 例 大 于 70 %。目前的人源化抗体 ,主要用于 肿瘤 、 自身免疫性疾病 和 心血管疾病的治疗 以及 抗移植排斥反应 和 抗病毒感染 等方面。 人源化抗体的临床应用 23 1 .在 肿瘤治疗 方面的应用 : 单抗药物抗肿瘤能有效地降低传统肿瘤药物治疗的 不良反应。如 2005年我国开发出癌症治疗药 重组人 源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体 (商品名：泰欣生 )。 泰欣生联合放疗治疗鼻咽癌的完全缓解率比单纯放疗的 患者提高 30%以上。 2 .在 器官移植 中的应用 : 近年来 ,利用抗体药物作为实体器官移植的诱导治疗 逐渐增加。如 1986年批准进入美国市场的治疗性抗体类 药物 抗 CD3单抗 即被用于肾、 心脏、 肝脏移植排斥的逆 转。 3 .在 心血管疾病 方面的应用： 美国 FDA 于 1994 年批准了第一个 人 -鼠嵌合 Fab 抗体 的上市，该抗体现已被广泛应用于多种心血管疾病 治疗 ,主要用于预防冠状动脉成形术后的再狭窄。 * 24 4 .在 自