蛋白组学定量蛋白质组学 ppt课件

蛋白质组学 1 第四章 定量蛋白质组学 Quantitative proteomics 定量蛋白质组学，就是把一个基因组表达 的全部蛋白质或一个复杂混合体系中所有 的蛋白质进行精确定量和鉴定的一门学科 。 2 n 蛋白质组学的研究目的是以大规模的尺度研究细胞 蛋白质的功能。 n 依靠 2-DE和质谱技术，蛋白质组的研究策略和方法 在细胞蛋白质的鉴定上已经比较成熟。 n 但是仅仅进行鉴定并不能提供用以阐明蛋白质的功 能的全部信息，监控蛋白质的表达水平对阐明细胞 体内存在的各种生物进程是非常重要的。因此，定 量蛋白质组学作为蛋白质组学研究的重要一部分被 提出来。 3 常用研究方法 n 以质谱技术为基础的化学标记定量方法 n 荧光差示双向凝胶电泳技术（ F 2D DIGE） 4 化学标记定量 n 对具有相同离子化能力的蛋白质或多肽，通过比较 质谱峰的强弱，可以得到其相对量的数值。 n 用一种质量标签来标记一种状态下的蛋白质，与另 一种状态下没有标记的蛋白质混合起来，进行质谱 分析，然后比较某个蛋白质没有标记的峰和标记后 峰的强弱，就可知道该蛋白质在这种状态下表达量 的变化。 n 常用的是在样品中加入包含稳定的重质同位素 (2H、 13C、 15N、 18O、 35S) 试剂 , 与被分析物结合而被标记 ，通过质谱检测以确定其蛋白质的表达水平。 5 标记方法 n 体内标记 n 15N体内 代谢标记 n 稳定同位素标记的 必需氨基酸 体内标记 (SILAC法 ) n 体外标记 n -NH2氨基标记 n COOH羧基标记 n -SH巯基标记 ICAT策略 6 （一）体内代谢标记方法 n 培养方法：将两种细胞样品分别置于正常培养介质 （ 14N）和富含某重质同位素（ 15N）的相同培养基中 培养。 n 蛋白质提取：培养一定时期后，将两者混合，然后 破细胞，提取相关部位感兴趣的蛋白质，进行消化 酶解。 n 鉴定：通过选择性亲和分离、色谱分离等过程，最 后进行质谱分析。每一对分析肽段与内标肽段在得 到的 质谱图 中表现为一对峰，峰的间距等于肽段中 所含的氮原子的个数。 7 酿酒酵母 G1细胞周期蛋白 Cln2的影响： cln2: 14N CLN2: 15N A: 翻译延伸因子 1a cln2 : CLN2 1： 0.93 B： 磷酸丙糖异构酶（ Tpi1） 代谢标记典型质谱图 8 体内代谢标记法具有较好的稳定性和重复性 9 15N体内代谢标记也可以 定量位点特异的化学修饰 n 磷酸化修饰定量： n X：未被磷酸化的肽段 n Xp：被磷酸化的肽段 n X被磷酸化成 Xp后分子 量会增大，在 MS图谱 上峰会迁移 10 特点 n 代谢标记方法比较准确和稳定 ,可以检测 蛋白质在 pmol浓度内的 20的量的变化 。 n 不能直接用于组织样品的分析。 n 同位素试剂需要量较大，成本高。 n 相同肽段的不同同位素标记形式之间的 质量变化依赖于氮原子数目，因此对未 知的蛋白质难以进行定量。 11 （二） 稳定同位素 标记的 必需氨基酸体 内 标记 (SILAC法 ) n 高等动物细胞的生长中需要一些必需氨基酸的摄入，如赖氨酸 (Lys)、亮氨酸 (Leu)、苯丙氨酸 (Phe)等，这些氨基酸细胞自身 无法合成，需要从外界摄入补充。 n 在培养细胞时，可以在培养介质中特异的加入用稳定同位素标 记的某一种必需氨基酸，在经过适当的培养时间后，细胞中合 成的含有这类氨基酸的蛋白质几乎都掺入了标记的氨基酸 。 n 收获不同同位素标记的不同生长状态下的细胞，混合裂解，再 做质谱，就可以从质谱图上得到蛋白质差异表达量的信息。 n 这种蛋白质定量策略称为 SILAC (Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture，细胞培养物中含有稳定同位素 的氨基酸标记 ) 12 SILAC法 : 鼠肌肉细胞分化 过程中蛋白表达量变化 Leu-d0 Leu-d3 (L-leucine-5,5,5- D3) Leu被标记：丰度最高氨基酸 13 Leu-d3可被细胞吸收 肽段： VAPEEHPVLLTEAPLNPK，带 3个电荷 14 3-磷酸 -甘油醛 -脱氢酶表达变化 15 n 用 Lys来标记明显好于其他的必需氨基酸， n 因为当用胰蛋白酶 (Trypsin)酶切时， n 保证了含有 Lys残基的每个肽段都只含有一个标 记物 n 避免了未知肽段用 15N标记所带来的质量变化不 清的类似问题 n 有利于蛋白质做 MS/MS鉴定时质谱图的解析 16 体内标记和体外标记比较 n 总的来说，体内标记相对于体外标记方法来说具有一些自身的 优势 n 省去了标记化学反应和分离纯化等步骤，因而减少了样品 的损失 n 有利于低丰度蛋白质的高灵敏度检测 n 体内标记也存在一些缺点 n 培养细胞在富含稳定同位素的介质中生长，这些介质可能 会影响细胞的繁殖和其他生物进程，由此改变蛋白质的表 达水平 n 这种方法受到同位素材料成本的限制，不可能整个动物体 进行标记 n 对于未知序列肽段，大多数的体内标记都无法确定标记物 与肽段之间量的关系，从而使得我们难以确认同一肽段在 质谱图上成对出现的不同同位素标记形式 17 体外标记常用方法 n -NH2氨基标记 n COOH羧基标记 n -SH巯基标记 ICAT策略 18 NH2标记（ d0/d3 、 d0/d4 法 ） n 多肽的 N末端和 Lys残基侧链上是 -NH2基团，容易跟含有 酰氧 基 的小分子如琥珀酸酐、 N-乙酰氧琥珀酰亚胺等发生 酰基化 反应，从而对肽段进行标记。 n 采用一种正常的酰基化试剂与分别含 3个（ d0/d3）、 4个氘原 子（ d0/d4） 的氘代酰基化试剂标记酶解后的多肽体系。该类 试剂可与肽的 N-端氨基 发生稳定的酰基化反应，还可与肽中 赖氨酸的 -氨基 反应。 n 当某肽段中不含赖氨酸时，分析物与内标物的质谱峰对分别相 差 3和 4个质量单位，被分析肽段中每增加一个赖氨酸残基，该 质谱峰对的差距就分别增加 3和 4个质量单位。 19 d0/d3标记蛋白质 N末端原理 n N-乙酰氧基琥珀酰亚胺 (N-Acetoxysuccinimide ) n 三氘代 N-乙酰氧基琥珀酰亚胺 (N-acetoxy- D3succinimide ) 20 MALDI-TOF /MS 分析 N末端乙酰化肽段 1195.6126 1198.6418 21 MALDI -TOF/MS 分析 N末端和 Arg的 NH2乙酰化肽段 1574.7610 1580.7624 22 E.coli 半乳糖苷酶蛋白水平 半乳糖苷酶蛋白表 达量可被诱导表达 提高到 2.5倍 诱导表达： 1H3标记 未诱导表达： 2H3标记 23 d0/d4标记蛋白质 N末端原理 n H4-Nic-NHS1-(H4-烟酰氧基 )琥珀酰亚胺 n 四氘代 H4-Nic-NHS1-(H4-烟酰氧基 )琥珀酰亚胺 24 MALDI-TOF mass spectrum of a peptide labeled with succinic anhydride and deuterated succinic anhydride 25 d0/d4修饰 N末端 NH2或 -NH2依赖反应条件 26 27 28 d0/d4标记用于分析蛋白质表达相对量 29 E.coli 在完全培养基和条件限制培养基 中的蛋白表达比较 30 d0/d4标记 37 点，进行 MS分析 n 37 点 ： 两个蛋白 n 一个蛋白量上没有变化（ *） n 一个蛋白在条件限制培养基中表达增加， 1:3 31 Lys上 -NH2特异标记方法： MCAT n O-甲基异脲 (O-methylisourea) 可以选择性地胍基化 Lys残基 上的 -NH2 。 n 不标记 N末端的 NH2和其它残 基侧链。 n “ 质量标记的丰度标签 ” (Mass-Coded Abundance Tagging， MCAT)的标记策略 。 n 每标记上一个胍基，片段分 子量增加 42Da。 32 MCAT策略流程：定性 n Lys只在 Trypsin酶切后的末端，所以产生的 b离子都没有被修饰；所有的 y 离子带 Lys， 因此被修饰。 n 在 MS/MS图谱上，所有的 b离子是单一条带出现，所有的 y离子是成对出现 ，丰度比例一样，且相差同样的 m/z。 n 容易区分 b离子和 y离子，容易读出氨基酸序列。 33 MCAT策略流程：定量 n 将来源不同样品的裂解物进行标记或不标 记，然后等量混合，经 LC分离，在 MS图 谱上就可分析不同蛋白量的变化 34 酵母细胞提取物的离子层析和 LC/MS图谱 ： 定性分析 肽段胍基化后分子 量增大，在层析图 上较晚出现。 35 肽段的定量分析 n 肽段被胍基后，分子 量增加 42Da，但是 带 2个电荷， m/z相差 21个单位 n 通过离子交换层析图 谱上峰的面积，可以 计算两种肽段的相对 量 0.88 : 1 36 MCAT优点 n O-甲基异脲 (O-methylisourea)对 Lys残基 - NH2的胍基化程度可以进行量上的控制 n 增加的质量（每个胍基 42 Da）可以很容 易在 MS上检测到 n -NH2的胍基化修饰并不影响肽 段 的离子 化和带电荷程度 37 COOH羧基标记 n 通过对羧基酯化进行 标记 n 用 H和 D标记的甲醇酯 化标记，来定量研究 蛋白质表达量的差异 38 羧基酯化标记进行蛋白定量研究 比例 2 : 1 39 n 缺点： n 特异性不是很好，在 C末端和 Asp和 Glu残基上都有标记，且效率不均 n 采用的标记条件容易引起天冬酰胺 (Asn)和谷氨酰胺 (Gln)的去酰胺 40 COOH羧基标记 n 在 H218O的溶液中进行蛋白酶切，从而特异性 的只在 C末端引入稳定的同位素标记 这类蛋白水解酶只在肽段的 -COOH端引入一个 18O 41 这类蛋白水解酶只在肽段的 -COOH端引入二个 18O 42 标记后的肽段在质谱上的分离 43 18O进行蛋白质组的标记和定量 44 -SH在标记反应中的作用 n Cys残基上的 -SH基团更具有标记反应的特异性 ，如烷基化试 剂如碘乙酸等能专一的对 Cys的巯基进行烷基化 。如果将稳 定同位素引入这些烷基化试剂，那么就可以通过比较质谱图 谱上成对出现的质谱峰信号的强度进行相对定量了。 n Cys是一种特殊的氨基酸，在蛋白质酶切产生的多肽片段不一 定含有 Cys残基。 E.coli和酵母细胞中含有 Cys残基的蛋白质分 别占到蛋白质总量的 85.7% 和 91.6% ，而在 trypsin酶切产生的 肽段中，含有 Cys残基的多肽分离仅占 9.4% 和 9.3% 。 n 如果能将这些烷基化标记的肽段给分离出来鉴定和定量，既 能检测到足够多的蛋白质，又大大减少了工作量，更适宜大 规模操作。 45 d0/d8法（ ICAT方法） 同位素标记的亲和标签方法 (Isotope Code Affinity Tag) ICAT试剂是一种人工合成的有机分子，包括三个部分： n 反应基团 ，可特异的与蛋白质侧链上的 Cys残基的巯基 (-SH)进行 反应，使试剂共价结合在蛋白质侧链上。 n 同位素标记的 接头 ，含有稳定同位素 (H和 D)的标记。 n 亲和标记的 生物素 ，用于分离标记的蛋白质或多肽。 46 reactive group biotin tag linker (heavy or light) S HN NH O N H O O O H H H H NH I OH H H H Light Reagent (D0) Heavy Reagent (D8) Isotope Coded Affinity Tag Reagents (ICAT) reactive group biotin tag linker (heavy or light) S HN NH O N H O O O D D D D NH I OD D D D 47 X = Hydrogen (light) or Deuterium (heavy) S H cys + Protein (reduced) ICAT Reagent (D0 or D8) ICAT labeled Protein 1) Label Proteins with D0/D8 ICAT Reagent, Digest S HN NH O N H O O O X X X X NH I OX X X X S cysS HN NH O N H O O O X X X X NH OX X X XTrypsin (or other enzyme) 48 ICAT labeled peptide + other peptides + Wash off other peptides then Elute from Avidin Avidin Elute Wash ICAT labeled peptide 2) Purify ICAT Labeled Peptides