β-甘露聚糖酶产生菌的筛选和酶学性质探讨.docx

-甘露聚糖酶产生菌的筛选和酶学性质探 讨 摘 要：从土壤中分离筛选出 5株产胞外 -甘露聚糖 酶的菌株，其中 DK3菌株的摇瓶培养液的酶活力达 3.85 U /ml。该酶水解葡甘露聚糖的最适温度为 37，最适 pH为 6.0，pH 稳定范围为 5.09.0 ，在低于 40的温度下基本 稳定。Fe 2+ 、Cu2+、EDTA 和 NH4+ 对该酶有抑制作用， Na+ 则有激活作用。 关键词： -甘露聚糖酶；筛选；酶学性质 -1,4-D-甘露聚糖酶(-1,4-D-mannan mannanohydrolase，EC.3.2. l. 78)是一类能水解含有 - 1,4-D-甘露糖为主链的多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、 葡甘聚糖等)的内切酶1。该酶用途广泛，能分解魔芋葡 甘露聚糖，生产能促进双歧杆菌生长、改善肠道菌群结构 的魔芋低聚糖；可作为工具酶用于天然多糖类结构的分析； 在造纸工业中，与 -木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同使 用，能除去纸浆中的半纤维素，改善纸质；在纺织工业中 用于纤维中半纤维素的降解，能有效去除纺织品所粘附的 多余染料；在饲料工业中用作酶添加剂，起到消除抗营养 因子的作用2-4。虽然 -甘露聚糖酶的应用前景广阔， 但目前总的来说，其低产和高成本限制了其应用范围和规 模，能改变这种状况的最重要的途径之一是筛选和培育产 高活力 -甘露聚糖酶的高产菌株。 1 材料与方法 1.1 土壤来源 土壤样品从广西大学农场甘蔗地、广西南丹县魔芋种 植地和南宁绿源肥料厂堆肥地采集。 1.2 试剂 葡甘露聚糖购自武汉市清江魔芋制品有限公司。 其它试剂均为分析纯试剂。 1.3 培养基 富集培养基：魔芋精粉 2.0，酵母膏 0.5，蛋白胨 0.3，NaCl 0.5； 固体分离培养基：魔芋精粉 1.0，NaNO3 0.3，MgSO47H2O 0.5，KCl 0.5， K2HPO4 0.1，FeSO47H2O 0.001，琼脂 1.0，pH6.0； 发酵培养基：魔芋精粉 1.0，酵母膏 0.5，蛋白胨 0.3，NaNO3 0.3，MgSO47H2O 0.5，KCl 0.5，K2HPO4 0.1，FeSO47H2O 0.001，pH6.0； 产酶培养基：魔芋精粉 1.0，NaNO3 0.3，MgSO47H2O 0.5，KCl 0.5，K2HPO4 0.1，FeSO47H2O 0.001，pH6.0。 1.4 菌株的分离和筛选 称取 1 g土壤于试管中，加入 l0ml蒸馏水，振荡混匀， 取 l ml接种到富集培养基中，37， 160 rpm培养 24 h。 选择培养液粘度明显下降的菌液，用无菌水梯度稀释后涂 布于固体分离培养基中，置 37培养箱中培养 24 h，用刚 果红染色，观察菌落周围有无透明圈，挑取透明圈大的单 菌落进行划线纯化。经纯化后的菌株在发酵培养基中培养 24 h，测定培养液中 -甘露聚糖酶的活力，筛选出酶活力 高的菌株。 1.5 -甘露聚糖酶粗酶液的制备 将菌株接种于发酵培养基中，37培养 24 h，按 l % 比例接入产酶培养基中，37，160 rpm培养 24 h。发酵 液离心所得上清液即为粗酶液。 1.2.4 -甘露聚糖酶酶活力的测定 酶活力的测定：取 0.4 ml 0.5%(w/v)葡甘露聚糖 (用 pH7.0，0.01 mol/L 磷酸钠缓冲液配制)，加入 0.1 ml 适 当浓度的酶液，37水浴反应 15 min，用 DNS法测定所产 生的还原糖7。 酶活力单位定义：在上述反应条件下，每分钟由底物 释放出相当于 1molD-甘露糖的还原糖所需酶量为 1个酶活 力单位(U)。 2 结果 2.1 菌株筛选 从土样中筛选出 5株产 -甘露聚糖酶的高产菌株,其 中 DK3菌株的摇瓶培养液的粘度下降快，菌落周围有大的 透明圈，摇瓶培养液中的 -甘露聚糖酶活力达 3.85 U /ml 。 表 1 菌株筛选结果 菌株编号 -甘露聚糖酶活力 DK1 DK2 DK3 DK4 DK5 2.21 2.42 3.85 3.30 3.00 2.2 酶学性质的研究 2.2.1 温度对酶活力的影响：在 3070下测定 -甘 露聚糖酶的活性，结果表明，该酶分解葡甘露聚糖的最适 温度为 37，在 3045都具有较高的活力。 图 1 -甘露聚糖酶促反应最适温度 2.2.2 温度对酶稳定性的影响：将酶液分别置于 40、50、60恒温水浴中处理，每隔 20 min取样，测定残 留酶活力。结果表明，该酶在 40下相对稳定。 图 2 -甘露聚糖酶的温度稳定性 2.2.3 pH对酶活力的影响：配制 pH3.0- 6.0，0.01mol/L Na 2HPO4-0.005mol/L柠檬酸缓冲液,pH 7.0-8.0,0.025 mol/L磷酸盐缓冲液和 pH9.0-10.0,0.05 mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液为酶促反应缓冲液，测定不 同 pH值下的酶活力。结果表明，酶促反应的最适 pH为 6.0。 图 3 -甘露聚糖酶促反应