【毕业学位论文】（Word原稿）水稻胚胎发育的转录组和蛋白质组研究

分类号 密 级 U D C 编 号 10486 武 汉 大 学 博 士 学 位 论 文 水稻胚胎发育的 转录组和蛋白质组研究 研究生姓名 ： 徐 红 指导教师姓名、职称 ： 王 建 波 教授 学 科 、 专 业 名 称 ： 生物学、植物学 研究方向 ： 植物细胞及分子生物学 二一 二 年 一 月 U 2012 郑 重 声 明 本人的学位论文是在导师指导下独立撰写并完成的，学位论文没有剽窃、抄袭、造假等违反学术道德、学术规范和侵权行为，本人愿意承担由此而产生的法律责任和法律后果，特此郑重声明。 学位论文作者： 2012 年 1 月 4 日 学位论文使用授权书 本论文 作者完全了解学校关于保存，使用学位论文的管理办法及规定，即学校有权保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权武汉大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入学校有关数据库和收录到中国学位论文全文数据库进行信息服务，也可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存或汇编本学位论文。 本论文提交 当年 / 一年 / 两年 / 三年以后，同意发布。 注：保密学位论文，在解密后适用于本授权书。 作者签名： 导师签名： 年 月 日 年 月 日 学院： 学号： 专业： 文创新点 本研究 以 作为重要粮食作物 的 单子叶模式植物水稻为研究对象， 运用转录组学与蛋白质组学相结合的方法， 大规模、 大 范围 地 分析 水稻胚胎 发育 各时期 基因在转录水平和翻译水平上的表达特点 及 变化规律 ，并与双子叶植物胚胎发育相关基因作比较，初步确定一些在单子叶植物胚胎发育 中 特有的基因表达特点 。 I 水稻胚胎发育的 转录组和蛋白 质 组 研究 博士研究生： 徐 红 指导教师： 王建 波 教授 （武汉大学生命科学学院，武汉 430072） 摘 要 胚胎发育是植物生长发育过程中一个非常重要的阶段， 目前 对单子叶植物胚胎 发育的机制了解甚少。 水稻作为遗传 发育 研究的单子叶模式植物 ， 全基因组测序工作的完成使 其 成为粮食作物中基因背景最为清晰的物种 。 本研究利用水稻作为研究材料 ， 通过对 胚胎发育过程中 转录组 及蛋白质组的动态变化 分析 ， 初步确认水稻胚胎发 育 相关基因的表达模式 ， 以期为理解植物胚胎发育的分子机理积累资料 。 运用 水稻胚胎发育 及成熟过程进行基因差异表达分析， 256对引物组 合共扩增出 33621条带，其中多态性条带 5727条。共选择了 319条中有 221个基因，可归入 11个不同的功能分类，如代谢 、蛋白合成与命运 、 转录调控 、 信号转导 、 细胞生长与分裂 、 转运等。 对 其 中 的 10个基因进行实时荧光定量 与 编码钙调素结合蛋白 、 铁离子通道转运蛋白 、 基因 及 生长素相关基因 在 3度表达。 参与细胞生长 分裂 、 氨基酸代谢 、 脂类代谢 、转运蛋白 、 糖酵解途径的基因 及 钙依赖蛋白激酶等基因在 5时，也检测到诸如 14检测 脂氧合酶等基因 的 特异表达。 14因 呈现出更为复杂的多态性，说明水稻胚胎发生过程相较于晚期成熟过程，存在着更为复杂的基因表达调控。 过 对三个发育时期 水稻胚胎（ 37 14 录组 的析，检测到了 27190 个基因的表达，每个时期胚胎分别检测到 23971、23732 和 23592 个基因表 达。在这些基因中，有 1131、 1443 和 1223 个基因依次分别为每个发育时期特异表达的 ，可见水稻胚胎发育过程中的转录组变化是相当大的。 通过进一步的统计学分析，确定了 1011 个基因在水稻胚胎过程中差异表达达到 2 倍以上。其中，在前两个时期（ 37 达显著差异的基因为 672 个，后两个时期（ 7 14 达显著差异的基因为 504 个。大量参与代谢 、 转录调控 、 核酸复制及加工 、 信号传导的基因在胚胎发育的早中期优势表达。 除此之外，还 检测到 大量转录因子在胚胎发育不同时期的表达。发现很多转录 因子家族 不仅在胚胎发育的起始阶段 发挥重要 的调控 作用 ， 也参与了 在胚胎发育的其他阶段 的调控 。 利用双向电泳（ 2 纳升级液相色谱 串联质谱 （ S）相结合的方法，对 授粉后 5 至 30 天 （ 5的水稻胚胎进行蛋白质组分析 ，调查在胚胎发育及成熟过程中蛋白质表达的动态变化 。 在水稻胚胎从 5测到 275 个表达量变化达到 2 倍以上的蛋白质。这些差异表达蛋白质大部分可归入 8 个不同的功能分类：代谢 、 蛋白质合成与加工 、 细胞生长与分裂 、 转运 、 转录 、 信号转导 、 疾病与防 御 、 储藏蛋白等。对这些差异表达蛋白质的表达模式进行等级聚类分析，结合功能分类， 发现在胚胎发育早期参与代谢 、 蛋白质合成等功能的蛋白高度表达，而在晚期胚胎成熟过程中参与物质储藏及脱水耐性的蛋白优势表达。 通过转录组和蛋白质组的分析 来 了解水稻胚胎发育及成熟过程中 基因 和蛋白质 表达 的 特点以及 表达 变化规律 ，可 为 进一步研究水稻及其它谷类作物的胚胎发育 奠定 一定的 基础 。 关键词： 胚胎发育， 水稻， 段长度 多态性 分析 ， 转录组测序， 双向电泳， 纳升级液相色谱 串联质谱 u 30072) is a in a of of of is an a we of in 9311). A to 3621 319 1 to of 0 in of YB 1of 37, 4 7,190 of ,131, 1,443, ,223. of A ,011 A 72 in -5 504 4 A of to in of In we at in in of by 2S). to in 75 0 of in in of in in of of of of in a on in 2S I 目 录 中文摘要 . 英文摘要 . 缩 略 词表 . 第 1 章 文献综述 . 1 物胚胎发育过程 . 1 物胚胎发育的基因表达研究 . 2 子激活过程的相关基因表达 . 2 胎极性建立及模式形成相关的基因表达 . 3 胎分生组织以及器官形成相关的基因表达 . 4 胎顶部区域发育相关基因 . 4 胎中部及基部区域发育相关基因 . 6 胎发育成熟相关基因 . 7 物转录组研究 . 8 达序列标签（ 术及应用 . 8 因芯片技术及应用 . 9 应用 . 10 因表达序列分析（ 技术及应用 . 11 规模平行测序（ 术及应用 . 12 应用 . 13 物蛋白质组研究 . 14 物组织器官发育蛋白质组 . 15 物亚细胞蛋白质组 . 16 物翻译后修饰蛋白质组 . 17 研究的目的和意义 . 17 第 2 章 水稻胚胎发育过程中基因差异表达分析 . 19 料与方法 . 19 稻材料 . 19 总 提取 . 19 合成 . 21 析 . 22 丙烯酰胺凝胶电泳（ 银染 . 25 据统计分析 . 26 异片段的 回收 . 27 异片段的琼脂糖凝胶回收与克隆 . 27 异片段的 测序与分析 . 29 时荧光定量 析 . 29 果与分析 . 31 稻胚胎发育过程的观察 . 31 稻胚胎总 取及质量检测 . 32 稻胚胎发育各时 期的 析 . 32 稻胚胎发育各时期基因表达模式分析 . 33 稻胚胎发育各时期的差异表达基因分析 . 35 分差异表达基因的实时荧光定量 析 . 36 论 . 38 第 3 章 水稻胚胎发育的转录组分析 . 40 料与方法 . 40 稻材料 . 40 提取 . 41 序（ 术流程 . 41 物信息学分析 . 42 时荧光定量 析 . 44 果与分析 . 44 序以及与参考基因组的比对 . 44 稻胚胎发育转录组整体分析 . 45 稻胚胎发育过程中表达基因的注释 . 48 稻胚胎发育各时期基因表达的变化 . 49 水稻胚胎发育差异表达基因的功能分析 . 51 稻胚胎发育差异基因表达模式聚类分析 . 53 分差异表达基因的实时荧光定量 析 . 55 论 . 57 第 4 章 水稻胚胎发育的蛋白质组分析 . 60 料与方法 . 60 稻材料 . 60 稻胚胎总蛋白的制备 . 61 一向等电聚焦电泳 . 61 二向 胶电泳 . 62 色 . 63 胶图像扫描与分析 . 64 谱鉴定与数据库搜索 . 64 白 表达模式的等级聚类 . 65 果与分析 . 65 稻胚胎发育的双向电泳图谱分析 . 65 异表达蛋白的质谱鉴定与功能分类分析 . 68 异表达蛋白的表达模式分析 . 70 酵解和三羧酸循环相关蛋白的表达分析 . 73 论 . 78 稻胚胎发育中代谢相关蛋白的表达特点 . 78 稻胚胎发育中 白的表达特点 . 80 稻胚胎发育各时期优势表达的蛋白 . 81 第 5 章 结论与展望 . 83 文的主要结论 . 83 望 . 83 参 考 文 献 . 85 在读期间发表及投稿论文 . 104 致 谢 . 105 略 词表 缩略词 英文名 2-P AA W S NA F 1 第 1 章 文献综述 胚胎发育是植物生长发育过程中一个非常重要的阶段， 由一个单细胞的合子经历了一系列复杂有序的发育过程，最终转变成多细胞的成熟胚。 通过 在 形态学上 显微观察 不同发育阶段的 胚胎 ， 很多 植物胚胎发育 的 过程 都 有 了 比较详细的描述。 近年来，随着越来越多新技术的出现，人们对植物胚胎发育的了解 又加深了很多。 物胚胎发育过程 在开花植物中， 胚胎发育是从双受精作用后形成的合子开始的 ，经过原胚和胚的分化发育阶段，最后达到成熟。 合子的不对称分裂形成两个 大小和命运不同的 细胞：顶 细胞（ 基细胞（ 。 随后，胚胎沿着两个不同的轴向（顶 育建成不同的器官和组织（ 2007）。从 2至胚胎器官开始分化之前的胚胎发育阶段称为原胚期。在原胚发育阶段，双子叶植物与单子叶植物之间有相似的发育形态，但胚的分化过程和成熟胚的 结构则有着很大的差异。 在双子叶植物中， 原胚依次经过球形期、心形期、鱼雷形期和成熟期最终成为成熟胚 。 在球形胚期，胚的 细胞 分裂 基本上是 同步进行 的 ， 胚胎没有明显的形态分化，呈球形。 随后的发育过程中分别在 以后要发育成 子叶 和 根 原基 的 地方 ，细胞分裂显 著 快 于其他细胞 ， 从而 最终 使 胚 胎在发育过程中依次 呈现心形 以 及 鱼雷形 （ 蒋丽等， 2007） 。 拟南芥、油菜和荠菜等植物 在 胚胎发育的早期分裂模式非常规范 ， 而 在许多被子植物中 ，类似的 规范化分裂模式并不存在 。 由于 单子叶植物胚 胎 只形成一片子叶，因此发育 过 程中不经过心形期和鱼雷形期。 单子叶 植物 与 双子叶植物 的 成熟胚器官差别 也 很大，如 茎生长点的位置 、 子叶 的 数目 等都不相同 。 胚 胎 发育 的 具体 阶段划分，因研究者 以 及植物种类 的 不同而异。 根据整个发育过程中胚胎的形态学特征，可将水稻胚胎发育过程划分为几个阶段。 水稻在开 2 花之后马上完成授粉，这个过程在夏季的中午大约只需要 15分钟。 授精 在授粉后几个小时内完成。之后大约一直到 授粉后 3天（ 3 合子一直重复进行 着细胞分裂 ， 胚 胎 尚 未出现器官分化 ，属于原胚期 。 然后，胚胎经历一个非常重要的分化 发育过程， 在 4 芽鞘、茎尖分生组织（ 胚根的原基几乎 同时可见。第一片叶原基出现在 5 二片叶原基出现在大约 7 下来 各部分 胚器官 逐渐 形成 ，到大约 授粉后 14天（ 14 右，胚胎达到形态学上的成熟 （ 徐雪宾 等， 1999） 。 传统胚胎学认为，到 达 这个阶段胚胎 的 发生 过程已经 完成。 随后， 胚胎各部分器官继续增大，一些 储藏物质 逐渐 在胚胎内累积 。 约从 21 胎体积开始逐渐变小， 随着种子的脱水干燥而 转入脱水干燥阶段，至 30 为干燥休眠的成熟胚 （ 张斌 和唐锡华 ， 1992； 2005） 。 物胚胎发育的基因表达研究 近 年来 ， 随着众多 植物胚胎突变体 的 研究， 许多在胚胎发育中发挥重要作用的基因被克隆 。通过对这些基因 功能及表达模式 的深入 分析 ， 发现了很多在胚胎发育过程的各个阶段调控或被调控以及特异表达的基因。 子 激活 过程 的 相关 基因表达 在拟南芥中， 早 被转录激活的 基因之一 ， 是一个 编码调节亚基 的基因 。 从 受精 卵 直至 球 形胚 期， 这个基因 只在 胚胎 某些 特定 的 位置 表达 ，对于 受精 后 的 有丝分裂过程是必须的 （ 2005） 。 除此之外 ， 码 细胞周期调控蛋白 的基因 ， 而 它是 在 期 转换 中发挥 重要作用 。能缺失 导致的 突变体 会 在合子期败育 ，其 在合子 的 单细胞时期就 已经 开始起作用 了 （ 2007） 。 在玉米合子中克隆到的一个 编码钙网蛋白 的基因，在受精之后的表达增强 ，因此推测 子 及相关蛋白在合子激活过程中发挥重要作用 （ 1994； 2008）。 还有一些基因被 3 认为在合子激活中起作用，如 可为合子激活提供能量（ 2005； 006）。 2006）认为 功能缺失突变体的胚胎发育在早期就受到阻抑。 许多关键基因 可能 参与 了 合子激活 的 过程， 但 由于雌配子体分离 困难等 诸多原因，对高等植物合子 的 激活机制 ， 我们的了解 仍 然很有限， 而对于 参与合子激活 以及 分裂的基因 了解得更加有限 。 胎极性 建立 及 模式形成 相关的基因表达 极性是指 在 细胞分裂之前 ， 胞质组分 的 不均匀 的 分布 。 植物胚胎 极性 的 建立对 整个胚的发育过程都 很 重要 （ 2000； 2005） 。两者的表达模式与参与的功能有所不同。 直持续到胚胎发育早期（ 995）。 2008）认为 而 从 拟南芥 和 菜豆 中克隆到的 推测 其 在 可能 通过作为 转录因子 来 调控 胚胎 早期 发 育 中 其他基因的表达（ 1995； 1999； 2008） 。 基因 541在红花菜豆 的 球 形 胚期特异性 地 积累 。 这两个基因主要在胚的基部表达，而在顶部检测不到表达，暗示了它们的功能可能与胚胎 极性相关 （ 2001）。 个 转运 蛋白，定位于植物细胞膜上，参与铁及其它可能金属离子的转运（ 2008； 2011） 。 拟南芥 尚未发育到 八分体 时就不再继续发育了，也暗示了这个基因在胚胎发育早期起重要作用（ 2002）。 研究表明胚胎的极性形成 是 与生长素有关 的 。 拟南芥 变体 在整个胚胎发生 的 过程中 ， 显示 持续的细胞分裂 ，但会 产生异常的胚轴、 胚 根和维管组织等 （ ， 2000） 。 基因 位于拟南芥第 4 条染色体 ， 与 胚胎早期发育 的整个过程 中对生长素 的响 应 密切相关 （ ， 4 2003） 。 另一 个 与生长素 相 关的 基因 ， 其突变体不能产生 两侧对称 的胚胎 （ ， 2001） 。最近， （ 2010）又研究发现 生长素与 作用可能是以直接或间接地方式 发生 的 ，从而影响了胚胎分化。 是 作为 转录因子调节 下游 基因 表达 的，同时也与 生长素 的 响应 有关（ ， 1997； 1998； ， 2003） 。 2010）发现 也可 通过调节一个转录因子而控制胚根的起始。 因家族成员如 通常都 在胚胎 发育的 早期 可检测到 表达 ，与生长素极性转运有关， 因此推测它们 对 胚胎 的 早期 发育存在很大影响 （ ， 2005； ， 2006） 。 （ 2003） 发现生长素 在基细胞中很少，相反 在顶细胞 中含量非常