2012版的分子细胞生物学研究方法-期末

1陈瑞川 （1）Gene transfer-to get stable cell line A. Transient（短暂的 ） transfection 1. Liposome（脂质体） -mediated gene transfer: Lipofectamine（脂质体） transfection 2.Ca3(PO4)2 mediated gene transfer 3.PEI（聚乙二胺 ） -mediated gene transfer 4. Electroporation（电穿孔 ） B. Stable transfection 1.Adenovirus infection（ 腺病毒感染） 2.Retrovirus infection（反转录病毒载体法 ） 3.Lentivirus infection（慢病毒载体转染法） 4.Co-transfection. （2）How to get Stable cell line 1.Infection or co-transfection 2. Antibiotics selection 3. Colonies growth 4. Expression detection 5. Cell line storage （ 3） Homology search of existing cDNA data bases GenBank Blast NCBI Blast Home Page:/BLAST/ Go to Protein Blast Page Paste your protein sequence or enter accession number of your protein into the box Usually select Protein-protein Blast. AK056946 Homo sapiens cDNA FLJ32384 fis, clone SKMUS1000104, weakly similar to Homo sapiens mRNA for HEXIM1 protein,complete cds. 2 俞春东俞春东 （ 1） 什么是近交系小鼠？它们有什么特性？有哪些常用的近交系小鼠？什么是近交系小鼠？它们有什么特性？有哪些常用的近交系小鼠？ 答：答： 近交系小鼠：近交系小鼠： 是经连续是经连续 20代（或以上）的全同胞兄妹交配（或亲代与子代代（或以上）的全同胞兄妹交配（或亲代与子代 交配）培育而成的小鼠，品系内所有个体都可追溯到起源于第交配）培育而成的小鼠，品系内所有个体都可追溯到起源于第 20代或以后代或以后 代数的一对共同祖先。代数的一对共同祖先。 特性：特性： 1.基因位点的纯合性（基因位点的纯合性（ Homozygosity） 近交系动物中任何一个基因位点上纯合子的概率高达近交系动物中任何一个基因位点上纯合子的概率高达 99，因而也能繁殖，因而也能繁殖 出完全一致的纯合子后代。出完全一致的纯合子后代。 2.遗传组成的同源性（遗传组成的同源性（ Isogenicity） 品系内所有动物个体都可追溯到一对共同祖先，个体在遗传上是同源的，品系内所有动物个体都可追溯到一对共同祖先，个体在遗传上是同源的， 基因型完全一致基因型完全一致 3.表型的一致性（表型的一致性（ Uniformity） 由于基因型的一致，近交系个体的表型也是相同的，在实验中用较少的由于基因型的一致，近交系个体的表型也是相同的，在实验中用较少的 近交系动物就可获得具有统计意义的结果。近交系动物就可获得具有统计意义的结果。 4.对外界因素的敏感性（对外界因素的敏感性（ Sensitivity） 由于近交系某些生理功能的稳定性降低，对外界环境因素变化的反应更由于近交系某些生理功能的稳定性降低，对外界环境因素变化的反应更 为敏感，这使近交系更容易被制备成疾病模型动物。供研究使用。为敏感，这使近交系更容易被制备成疾病模型动物。供研究使用。 5.遗传特征的可辨性（遗传特征的可辨性（ Identifiability） 每个近交系都有自己的标准遗传概貌，选择适当的遗传监测方法，即可每个近交系都有自己的标准遗传概貌，选择适当的遗传监测方法，即可 分辨各个近交系。分辨各个近交系。 6.遗传组成的独特性（遗传组成的独特性（ Individuality） 每个近交系都具有独特的遗传组成和独特的生物学特性。由于这一特点，每个近交系都具有独特的遗传组成和独特的生物学特性。由于这一特点， 采用某近交系所作的实验结果往往不直接代表整个种属的反应，而必须在采用某近交系所作的实验结果往往不直接代表整个种属的反应，而必须在 多个近交系作动物实验，以增加其代表性。多个近交系作动物实验，以增加其代表性。 7.分布的广泛性（分布的广泛性（ Extensity） 同一品系在不同地区不同国家都广泛存在，引种方便并利于研究结果的同一品系在不同地区不同国家都广泛存在，引种方便并利于研究结果的 交流。交流。 8.背景资料的可查性（背景资料的可查性（ Accessibility） 具有一份完整的研究背景资料，便于实验设计和结果分析。具有一份完整的研究背景资料，便于实验设计和结果分析。 国内外常用近交系小鼠国内外常用近交系小鼠 1. BALB/c系系 （ 1）遗传背景：）遗传背景： 起源：起源： Dowell于于 1913年开始维持的白化小鼠，从年开始维持的白化小鼠，从 1923年开始年开始 近亲交配，近亲交配， 1932年年 Snell获得其获得其 26 代近交系。代近交系。 1985年年 180代从代从 NIH引到引到 IMLAS。 近交代数：近交代数： 180(美国美国 NIH1985)。 毛色和毛色基因：白化，毛色和毛色基因：白化， AA、 bb、 cc、 DD。 主要亚系为主要亚系为 BALB/ccd, BALB/cJ, BALB/cAnN等。等。 （ 2）特性：乳腺癌发病率低，与其他品系相比血压较高，对慢性肺炎敏感，对）特性：乳腺癌发病率低，与其他品系相比血压较高，对慢性肺炎敏感，对 放射线特别敏感，繁殖期长。放射线特别敏感，繁殖期长。 （ 3）应用：广泛应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核医学和单克隆抗体等研究）应用：广泛应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核医学和单克隆抗体等研究 中。中。 2. C57BL系系 毛色毛色 黑色（隐性）黑色（隐性） （ 1）遗传背景：）遗传背景： 起源：起源： 1921年年 Little由由 Abby Lathrop得到动物后开始近亲交配，得到动物后开始近亲交配， 育成数个近交系，雌鼠育成数个近交系，雌鼠 57号与雄鼠号与雄鼠 52号交配而得号交配而得 C57BL， 1937年分开年分开 C57BL/6及及 C57BL/10两系。两系。 1985年引到年引到 IMLAS。 近交代数：近交代数： 150(Jax,1984)。 毛色及毛色基因：黑色，毛色及毛色基因：黑色， aa、 BB、 CC、 DD。 主要亚系为主要亚系为 C57BL/6J, C57BL/6N, C57BL/10J等。等。 （ 2）特性：乳腺癌发病率低，对化学致癌剂不敏感，全身照射后淋巴瘤发病率）特性：乳腺癌发病率低，对化学致癌剂不敏感，全身照射后淋巴瘤发病率 99 100，干扰素产量高。，干扰素产量高。 （ 3）应用：常被认作）应用：常被认作 “标准标准 ”的近交系，为许多突变基因提供遗传背景，是肿瘤的近交系，为许多突变基因提供遗传背景，是肿瘤 学、生理学、免疫学、遗传学研究常用品系。学、生理学、免疫学、遗传学研究常用品系。 3. 129sv 系系 毛色毛色 agouti 棕褐色（显性）棕褐色（显性） 应用： 1980年代，具稳定性的小鼠胚胎干细胞株皆源自129/Sv纯系小鼠 。1990 年代，基因定位 (gene targeting) 试验结果证实其为极成功的动物模型。 4. FVB 系系 毛色白化毛色白化 起源起源 源自远交系源自远交系 Swiss鼠。鼠。 1935 年，在年，在 NIH 饲养，饲养， 1966 年起开始选育，在年起开始选育，在 接种百日咳疫苗后，其中一系接种百日咳疫苗后，其中一系 HSFS/N对组胺对组胺 (Histamine)敏感。敏感。 70 年代初，年代初， 在在 HSFS/N 系第八代发现部份小鼠携带系第八代发现部份小鼠携带 Fv1 b 基因对基因对 B strain Friend 白血病白血病 毒敏感，后育成毒敏感，后育成 Fv1 b 同型合子近交系，称同型合子近交系，称 FVB。 NIH 、 Jackson等保存。等保存。 应用：应用： FVB 通用于转基因实验，有较强的繁殖力，窝仔数多，受精卵有大而显通用于转基因实验，有较强的繁殖力，窝仔数多，受精卵有大而显 著的前核，易于显微注射著的前核，易于显微注射 DNA。 3. 我国培育的小鼠近交系我国培育的小鼠近交系 1946年，我国从印度Haggkine研究所引入小鼠，这是当今广泛应用的昆明种小鼠 的原种。 应用优点应用优点 （ 1）遗传组成和遗传性状一致，对实验反应一致，因此，只需用少量的动物就）遗传组成和遗传性状一致，对实验反应一致，因此，只需用少量的动物就 可得到非常规律的实验结果。可得到非常规律的实验结果。 （ 2）组织相容性抗原一致，异体移植不产生排斥反应，是组织细胞和肿瘤移植）组织相容性抗原一致，异体移植不产生排斥反应，是组织细胞和肿瘤移植 实验中最为理想的材料。实验中最为理想的材料。 （ 3）明显的生物学特征，如先天畸形，高肿瘤发病率，对某些因子敏感和耐受）明显的生物学特征，如先天畸形，高肿瘤发病率，对某些因子敏感和耐受 等，这些特点在医学研究中是天然模型。等，这些特点在医学研究中是天然模型。 （ 4）多个近交系同时使用不仅可分析不同遗传组成对某项实验的不同反应与影）多个近交系同时使用不仅可分析不同遗传组成对某项实验的不同反应与影 响，还可观察实验结果是否具有普遍意义。响，还可观察实验结果是否具有普遍意义。 1909年，年， C.C. Little首先采用近亲繁殖，培育了首先采用近亲繁殖，培育了 DBA近交系小鼠，成为实验动物近交系小鼠，成为实验动物 发展史上发展史上 第一个近交系动物。第一个近交系动物。 （ 2） 设计实验，用基因敲除的方法研究一个基因的作用。设计实验，用基因敲除的方法研究一个基因的作用。 基因敲除（基因敲除（ knock-out） 是是 20世纪世纪 80年代后半期应用年代后半期应用 DNA同源重组原理发展起来同源重组原理发展起来 的一门新技术，指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，的一门新技术，指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验， 将该基因去除或用其他序列相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相将该基因去除或用其他序列相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相 应基因的功能。应基因的功能。 目前，建立基因敲除动物最常使用的是小鼠（常用的品系为目前，建立基因敲除动物最常使用的是小鼠（常用的品系为 129/SV）的）的 ES细胞细胞 主要是因为主要是因为 ES细胞是利用小鼠囊胚内细胞团中的多潜能细胞建立的，在体细胞是利用小鼠囊胚内细胞团中的多潜能细胞建立的，在体 外白血病抑制因子（外白血病抑制因子（ LIF）可维持其多潜能未分化的状态，另外）可维持其多潜能未分化的状态，另外 ES细胞有细胞有 利于各种体外操作，具有发育成胚系各种组织的能力。利于各种体外操作，具有发育成胚系各种组织的能力。 步骤： 1.构建打靶载体（含有一段与欲敲除的基因具有高度同源性外源基因并插入一 带有启动子的选择标记基因） 2.含有修饰后外源基因的载体利用转染的方法，如磷酸钙共沉淀、电转移和逆 转录病毒介导等方法导入ES 细胞中 3.外源基因与染色体上的靶基因发生同源重组，把修饰的外源基因置换到ES 细 胞，通过筛选标记基因而检出发生同源重组的ES 细胞并在体外扩增 4.此ES 细胞注入供体囊胚,再将带有此ES 细胞的囊胚胎移植到假孕鼠的子宫内， 发育成一个嵌合体 5.经过进一步杂交传代的方法，使外源基因纯合，即建立成基因敲除动物模型 正负双向选择法正负双向选择法 ( PNS法法 ) 为了提高同源重组效率，减少后阶段的工作，常用的方法是正负双向选择法( PNS法) 。 Capecchi PNS 法所设计的载体包含1015kb 并与靶基因同源的片段，一个neo 基因( neo 为新霉素抗性基因) 插入到载体同源序列内的一个外显子中部，载体 中插入neo r基因的目的主要是打断靶基因的编码序列，整合重组细胞的一个选 择标记，因neo r基因对G418 (氨基糖苷抗生素) 耐受而成活，反之，ES 细胞死 亡而淘汰。自杀基因HSV-tk 位于打靶载体的同源序列与非同源序列之间，反向 选择是根据同源重组发生时,同源片段(HSV-tk)(单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基 因) 将被切除，而发生随机整合时，由于tk 的存在而使ES 细胞被Ganciclovir 杀死，用这种方法可使同源重组的筛选效率提高2 2000 倍不等。 (3)07年诺贝尔生理或医学奖得主？工作技术路线？工作意义？ 年诺贝尔生理学或医学奖授予来自美国的马里奥卡佩奇、奥利弗史 密斯和来自英国的马丁伊文思因胚胎干细胞研究获该奖项。 这三位科学家是因为“ 在涉及胚胎干细胞和哺乳动物 DNA 重组方面的一系列突 破性发现”而获得这一殊荣的。这些发现导致了一种通常被人们称为“ 基因打靶” 的强大技术。这一国际小组通过使用胚胎干细胞在老鼠身上实现了基因变化。 凭借基因敲除技术，科学家可以对小鼠的基因逐个加以研究。这对疾病的分子 机理研究、基因治疗等具有重大意义。因为他们在“利用胚胎干细胞对小鼠基因 进行定向修饰原理方面的系列发现”，直接催生了基因靶向技术，深远影响了现 代生物医学的研究面貌。 3王亚梅 1.简述02年诺贝尔奖的研究贡献？06年？ The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2002 “for their discoveries concerning genetic regulation of organ development and programmed cell death ” Sydney Brenner H. Robert Horvitz John E. Sulston 年诺贝尔生理学或医学奖分别授予了英国科学家悉尼布雷内、美 国科学家罗伯特霍维茨和英国科学家约翰苏尔斯顿，以表彰他们发现了在器 官发育和“程序性细胞死亡” 过程中的基因规则。 英国科学家悉尼布雷内他选择线虫作为新颖的实验生物模型，这种独特的 方法使得基因分析能够和细胞的分裂、分化，以及器官的发育联系起来，并且 能够通过显微镜追踪这一系列过程。 美国科学家罗伯特霍维茨他发现了线虫中控制细胞死亡的关键基因并描绘 出了这些基因的特征。他揭示了这些基因怎样在细胞死亡过程中相互作用，并 且证实了人体内也存在相应的基因。 英国科学家约翰苏尔斯顿他的贡献在于找到了可以对细胞每一个分裂和分 化过程进行跟踪的细胞图谱。他指出，细胞分化时会经历一种“程序性细胞死亡” 的过程，他还确认了在细胞死亡过程中控制基因的最初变化情况。 意义：目前一些国家的科学家已经开始利用“程序性细胞死亡”的机理， 研究可以治疗多种疾病的新方法，一些医药生物科技公司已经开始在进行这方 面的临床实验。不久的将来，由今年这3位诺贝尔生理学或医学奖获得者开创的 “程序性细胞死亡”机理研究将可能在人类战胜疾病中发挥出重大的作用。 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 “for their discoveries of RNA interference gene silencing by double stranded RNA” Andrew Z. Fire Craig C. Mello 2006年诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁菲尔和克雷格梅 洛，以表彰他们发现了 RNA 干扰现象。 今年诺贝尔医学奖获得者发现了一个有关控制基因信息流程的关键机制。人们 的基因组通过从细胞核里的 DNA 向蛋白质的合成机制发出生产蛋白质的指令运 作，这些指令通过 mRNA 传送。美国科学家菲尔和梅洛公布了他们发现一种可以 从特定基因降解 mRNA 的方式，在这种 RNA 干扰现象中，双链 RNA(double- stranded RNA)以一种非常明确的方式抑制了基因表达。 植物、动物、人类都存在 RNA 干扰现象，这对于基因表达的管理、参与对 病毒感染的防护、控制活跃基因具有重要意义。RNA 干扰已经作为一种强大的 “基因沉默”技术而出现。这项技术被用于全球的实验室来确定各种病症中哪 种基因起到了重要作用。RNA 干扰作为研究基因运行的一种研究方法已被广泛 应用于基础科学，它可能在将来产生新的治疗方法。 RNA 干扰(RNA interference，RNAi)是一种可以在细胞内抑制特定基因表达 的现象。它由双链 RNA 产生，可以特异性地降解具有相同或者相似序列的 RNA（包括 mRNA） 。它是一种比反义技术更为有效的方法，具有更高的特异 性。 关键点：确定1921 寡核苷酸， cDNA转录成mRNA的试剂盒（效果好） ，或 表达载体p-Super, 转染试剂盒； 不足：干扰不够稳定，不能长时间作用 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009 年诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家伊丽莎白布莱克本、卡萝 尔格雷德和杰克绍斯塔克，以表彰他们“发现端粒和端粒酶是如何保护染 色体的” 。 即染色体在细胞分裂过程中是怎样实现完全复制，同时染色体如何受到保护而 不至于发生降解。 布莱克本和绍斯塔克发现，端粒中有一个特定的序列保护染色体不被降 解，而布莱克本和格雷德则鉴别出了端粒酶。 端粒的缩短可能是导致衰老和诱发骨髓、肺部及皮肤病变的原因。如果端粒的 长度得以维持，细胞衰老就能够延缓。这一重要发现也有助于医学界更好地研 究如癌症等疾病的产生过程。 2.C-elegans两种转基因技术及其可解决的问题？ （1）Transformation by microinjection（显微注射 ） Microinjection is one way of transformation to put DNA into living cells. It has been successfully used with large frog eggs, C. elegans, cultured mammalian cells, mammalian embryos, and plant protoplasts（植物原生质体）and tissues. Purposes: 1) identification of genes by rescuing a mutant phenotype（表型） using a WT copy of the gene 2) Expression pattern using the gene of interest with reporter 3) Interference of a biological process by overexpression of WT or mutated gene （2）Transformation by Particle Bombardment（轰击） 1）Physically introducing DNA into cells with a gene gun. 2）Very tiny DNA-coated metal particles are suspended（悬浮） in a drop on a macroprojectile（大发射体）. 3）A discharge（释放；排出） (from a gun powder explosion or from breakage of a membrane enclosing a pressurized（加压的） chamber（室）) impels（推动 ） the macroprojectile. 4）The macroprojectile is stopped by a stopping plate, but the microprojectiles continue into the tissue below. 5）The DNA introduced with the particles is expressed. Advantages: Low copy number High integration rate to the genome Disadvantages: Require large number of worms 3.研究C-elegans基因功能时用的RNA干扰方法？并比较他们的优缺点？ 1） Feeding RNAi in C. Elegans Feeding on E. coli that produces dsRNA 2）Systemic RNAi in C. elegans RNAi library (J. Ahringer) 16,757 bacterial clones, each expressing dsRNA homologous to one C. elegans gene (covering 87% of all genes) 3）Genome wide RNAi screen A powerful reverse genetic approach for gene discovery for any biological function 优点：Sensitive, specific and scalable 1）injecting dsRNA (tedious, effective单调烦琐但效率高) 2）soaking（浸泡，渗透） dsRNA (relatively easy) 3）feeding E.coli HT115 expressing dsRNA (easy, can be used at genome scale) The Mechanism of RNA interference (RNAi) 1）Double-stranded RNAs (dsRNAs; 200 nt) get processed into 20-25 nt small interfering RNAs (siRNAs) by Dicer（RNaseIII 家族中特异识别双链 RNA 的一 员）. 2）The siRNAs assemble into endoribonuclease（内切核糖核酸酶）- containing complexes known as RNA-induced silencing complexes (RISCs). 3）The siRNA strands are then unwound（展开） to form activated RISCs. 4）The siRNA strands subsequently guide the RISCs to complementary（补 充的，互补的） RNA molecules, where they cleave and destroy the cognate（同源的） RNA. 5）Cleavage of cognate RNA takes place near the middle of the region bound by the siRNA strand. 4吴乔 1.免疫沉淀/免疫印迹（Immunoprecipitation/Western blot ） 这个实验是用特异性抗体结合细胞裂解液中的目的蛋白质，洗涤后解离特异性 抗体和目的蛋白质，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ） ，最后用Western blot 分析目的蛋白质。这种方法可以分析溶液中的、细胞内的、结合在细胞膜 上的蛋白或受体，但只能是定性或半定量的实验。 2.凝胶阻抑实验（ Gel retardation assay） 基本原理：当DNA结合蛋白与相应的DNA片段或寡核苷酸结合而形成DNA-蛋 白质复合物后，使DNA片段的分子量及电荷发生改变，因而在聚丙烯酰胺 凝胶电泳体系中其电泳迁移率发生改变，通常较游离的DNA片段的泳动速 率慢得多，在X光胶片上形成一较游离DNA片段滞后的带型。 实验过程：DNA片段(probe) 进行末端标记（同位素、生物素或荧光） - probe与核蛋白孵育 -电泳-干胶-曝光 3.蛋白质泛素化过程？E1,E2,E3,A蛋白酶体的作用？ 泛素是一种小蛋白，只有76个氨基酸（MW8.6KD） 。目前发现所有生物的泛 素都是由氨基酸编码的，而且序列相当保守。 比较人与酵母的泛素序列，只有 3个氨基酸不同。 泛素的二级结构包括了5个- 折叠，3-5个螺旋及7个反螺旋，其外观是一个紧 密压缩的球状蛋白质，从球体的表面伸出4个C-末端残基，作为泛素化蛋白质 的结合位点. 泛素肽链中约70%由氢键组成，决定了它的热稳定特性及耐受宽范围的pH 值。 泛素的功能位点是C-末端，用以结合蛋白质，而其Lys-48则作为其它泛素 的结合位点，用以形成泛素链。 泛素-激活酶（Ubiquitin-Activating Enzyme, E1）：在人类仅发现一种，主 要功能是激活泛素; 泛素-结合酶(Ubiquitin-Conjugating Enzyme, E2)：分子量较小，都有一个 UBC结构域，可特异识别泛素，并与泛素结合，同时还具有识别E3 的功能; 泛素-蛋白连接酶(Ubiquitin-Protin Ligases, E3)：一类大分子蛋白质，结构 复杂，主要作用是特异识别靶蛋白，并将其传递给蛋白酶体降解; 泛素链组装因子(Ubiquitin Chian-Assembly Factor, E4)：结合泛素并催化 E1、E2、和E3 的组装, 对多聚泛素链的延长起重要作用 。 蛋白酶体（26s）：包括一个20s 的中心颗粒和一个19s的调节颗粒，在20s 颗 粒中心由七个亚基的四个环组成一个中空室。 亚基主要用于底物识别，亚 基主要参与底物降解。 泛素C末端水解酶（ UCHs）：UCHs 多为含巯基蛋白酶，分子量大小不等，能 特异识别泛素C末端区域，解离泛素与靶蛋白的结合, 促进泛素再循环，所以 对泛素系统的正常运行很必要。 4.SUMO化蛋白 SUMO (small ubiquitin-related modifier) 是一种小的泛素相关修饰蛋白， 它与泛素在序列上虽只有18相同，但在二级结构和三级结构上有惊人的相似。 SUMO化（sumoylation）的功能与泛素化(ubiquitination)不同，它并 不使蛋白降解，反而加强它们的稳定性或调节它们在细胞内的定位和分布，甚 至与凋亡相关. SUMO家族成员包括 SUMO-1， SUMO-2， SUMO-3。它们广泛存 在于原生动物、后生动物、植物和真菌中，显示了SUMO 在进化上的保守性。 SUMO家族成员都有独特的N端氨基酸序列和碳端外延序列。在所有的 SUMO 家族成员中，甘氨酸甘氨酸残基对 SUMO结合是必须的。 5.核定位序列（nuclear localization sequence, NLS） 单一型NLS，由一段连续的碱性氨基酸顺序排列而成（RKKKRKV） 双分型NLS，由两簇碱性氨基酸被中间1012个非保守性氨基酸所分隔而形 成；（KRPAATKKAGQAKKKKLDK） 5韩爱东 1.表达和纯化蛋白首先要考虑的因素和条件？ 1） Obtain the cDNA by amplifying either genomic DNA (prokaryotic genes, or eukaryotic genes with no introns内含子) or full-length, sequence-verified明 确了的 cDNAs (eukaryotes) or by total gene synthesis. 2）Use ligation连接反应-independent cloning (LIC) to clone the full-length cDNA (or the fragment of interest) into an E. coli expression vector. 3）Use T7 RNA polymerasedriven expression and an N-terminal oligohistidine寡聚组氨酸 tag (include a cleavage酶切 site for a sequence- specific protease to enable removal of the tag). 4）Express the protein in a derivative 衍生物 of the E. coli BL21(DE3) strain, with induction 诱导 at low temperature (1525 C) in rich medium and with good aeration 通风条件. If expressing proteins from organisms that have codon 遗传密码子 biases 偏爱性 differing from those used by E. coli, use a strain supplemented with the appropriate tRNA genes. 5）Solubilize 使溶解 and purify the protein in a well-buffered solution containing an ionic strength equivalent to 300500 mM of a monovalent 单价的 salt, such as NaCl. 6）Use immobilized固定化的 metal affinity chromatography (IMAC) as the initial purification step. 7）If additional purification is required, use size-exclusion 大小排除 chromatography (gel filtration). If necessary, use ion exchange chromatography as a final polishing step. 8）The affinity tag may be removed to minimize non-native sequences in the recombinant protein and to achieve further purification. Use a recombinant, hexahistidine 六聚组氨酸-tagged protease and reapply the sample to IMAC column to remove the protease and any cellular proteins that bound to the metal affinity resin 树脂. 2.蛋白质结构构象的研究方法 1）Electron microscopy Electrons: eg.0.04 at 100kV Resoluon: beVer than 3 Magnicaons: 2,000,000X (light microscope 2000X) Limits: phase loss, sample thickness (10kD BeVer resolved by isotopes 1H, 15N,13C and 2D 3）Paramagnetic relaxation enhancement Chemical shis with induced PRE Coupled with molecular dynamics simulaons Ensemble averaging of large number of molecules Internuclear distances measures as restraints Cluster analysis Gyration radius Contact regions 3.制备目的蛋白的步骤 Prepare protein/nucleic acid samples Extracts from original cells, tissues and organs Synthesis: DNA, RNA, small molecules, peptides Heterologous expression Protein expression in bacteria Inexpensive using E.coli or bacillus subtilis Well-developed XL1blue, Top10, BL21/DE3, pLysS, Rosetta Lack of appropriate modications Phage recombination in E. Coli Make protein in test tube: cell free Protein/nucleic acid purication Afnity tags: His, GST, MBP, avidin, ag Chromatography Ion exchange: Q sepharose, SP sepharose Hydrophobic: phenyl, butanol sepharose Characterize samples before screens SDS PAGE for purity, potential contamination Quantication Buffer optimization Stability Activity to check folding 4.Why proteins crystallize?为什么蛋白要结晶？ 1）Principle: maximize entropy，minimize free energy 2）Driving force: non-covalent bonds do not form in solution stronger than in solution Uniformed (Heterogenous molecules mess up) 5.Achieve supersaturation（超饱和状态） 1）Increase precipitant concentration slowly