泰妙菌素生产菌原生质体等离子诱变选育研究

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 泰妙菌素生产菌原生质体等离子诱 变选育研究 摘 要采用等离子诱变技术，以 泰妙菌素生产菌原生质体为诱变材料， 对泰妙菌种 TMII15-21 进行诱变选育， 通过筛选得到两株泰妙高单位菌株： TMII17-51、 TMII17-68。经发酵摇瓶验 证，其摇瓶效价分别高于出发菌株 18.5%、 20.2%。连续传代实验结果表明 其传代稳定性良好。 中国论文网 /1/view-12829837.htm P 键词泰妙菌素；原生质体； 等离子诱变；选育 中图分类号：S859.79+6 文献标 识码：A 文章编号： 1009- 914X（2018）26-0197-01 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 泰妙菌种隶属于担子菌纲、伞菌 目、斜盖伞属（Clitopilus prunulus） ，为 双核真菌1。截短侧耳素是该菌属产生 的次级代谢物之一，而截短侧耳素是合 成延胡索酸泰妙菌素的前体物质。截短 侧耳素为三环二萜类化合物，该物质合 成的关键酶是二萜环化酶2。泰妙菌素 产生菌遗传背景资料不足，尚不能应用 基因工程手段对其进行特异性改造。 目前该菌种常用的育种方法为自 然选育和诱变育种，以物理诱变居多。 紫外诱变、紫外结合氯化锂诱变、紫外 结合亚硝基胍诱变、重离子诱变，均有 报道。等离子诱变是新型的物理诱变技 术，能够在常温常压下开展，与传统的 紫外诱变相比，能够造成更加多样的 DNA 损伤，突变率高，且易于获得遗 传性状稳定的突变株3。因此，本研究 采用等离子诱变开展本项目。 原生质体是等离子诱变的良好材 料。相对于菌丝体而言，原生质体缺少 细胞壁的保护，更有利于高能粒子进入 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 细胞内部对基因组进行攻击，有利于提 高突变率4。综上，本研究采用原生质 体等离子诱变技术对泰妙菌株进行改造。 这两项技术的结合有利于提高突变率， 有利于获得产量性状发生重大变化的菌 株。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 泰妙菌素生产菌 （Clitopilus prunulus） ，菌种号： TMII15-21，宁夏泰瑞制药股份有限公 司菌种研究室保藏。 1.1.2 仪器与设备：LDZX- 75KBS 立式蒸汽压力灭菌器（上海申安 医疗器械厂） 、YT-CJ-2N 双人双面净化 工作台（北京亚泰科隆仪器技术有限公 司） 、HZQ-F280 全温振荡培养箱（太仓 市华美生化仪器厂） 、PSX 智能型恒温 恒湿培养箱（宁波莱福科技有限公司） 、 氦气常温常压等离子体（ARTP）诱变 育种仪（北京思清源生物科技有限公司） 。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 1.1.3 培养基：种瓶培养基：马 铃薯 20%（浸提液） 、葡萄糖 4.2%、 pH=6.3。 原生质体再生培养基：马铃薯 20%（浸提液） 、葡萄糖 2%、琼脂 1.56%、 蔗糖 2.7%、pH=6.55。发酵瓶培养基： 葡萄糖 6%、玉米浆 4%、硫酸镁 0.05%、豆油 2%。斜面培养基：马铃薯 20%（浸提液） 、葡萄糖 2%、琼脂 1.56%、 pH=6.5。以上培养基均在 121.0灭菌 30min。 1.2 方法 1.2.1 原生质体制备 取培养 72h 的种子液 30mL，3000r/min 离心 10min 收集菌丝。 将过滤除菌的酶液 20mL 加入到上述菌 丝中，25酶解 33.5h，期间每隔 0.5h 振荡混匀一次。最后用 G2 砂芯漏 斗过滤，收集滤液6。 1.2.2 ARTP 诱变 按上述方法得到的泰妙生产菌原 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 生质体制备率可达 1.5106 个/mL，制 备 10ml 原生质体滤液，用移液吸取 30ul 涂至已灭菌的不锈钢载片上，将载 片置于在载物台上，调整载物台高度设 定为 25mm、氦气流量 8slpm、功率 40W，分别照射 30、60、90、120、150、180、210 和 240s。 将照射后的载片移至装有 1ml 磷 酸盐缓冲溶液中，振荡 30s，将附着在 载片上的原生质体洗下，并稀释至 10- 1、10-2 、10-33 个梯度，每个梯度涂布 5 个再生培养基平板，25培养 12 天， 以未照射滤液为对照，通过菌落计数法 按下式计算致死率：致死率（%） =（N 对 -N 诱） /N 对*100 ，其中，N 对 为对照菌落数，N 诱诱变处理后菌落数， 绘制致死曲线图。同时，将不同照射时 间的单菌落进行摇瓶验证，计算正突变 率。 1.2.3 突变株的筛选 将诱变处理后的菌液稀释一定倍 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 数后涂布于原生质体复苏平板中，25 温度下培养 12-15 天后挑取圆形、白色、 直径约为 10mm 的单菌落，接种于种瓶 培养基中，25、培养 120h 后转入发 酵培养基中，继续振荡培养 216h 后用 HPLC 方法测定其化学效价，根据初筛 化学效价挑选较高的菌株进行复筛验证。 最终根据复筛结果留取高单位菌株。 1.2.4 突变菌株稳定性验证 将已经选取的高单位菌株在斜面 培养基中连续传代五次后进行发酵摇瓶 验证，方法同上。根据摇瓶化学效价判 定其遗传稳定性。 2 结果及讨论 2.1 照射时间的确定 当照射时间为 30s 时，致死率为 37%，正突变率为 19%；当照射时间为 90s 时，致死率为 79%，正突变率为 50%； 照射时间为 210s 时，致死率为 99%， 正突变率为 5%。致死率随着照射时间 的增加逐渐升高，正突变率随着照射时 间的增加先升高后降低。因此，选择照 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 射时间为 90s。 2.2 泰妙菌素生产菌高单位菌株 选育 由上述实验确定照射时间为 90s，在此条件下，挑选复苏后的单菌 落 208 株，经初筛后，挑选效价单位高 于出发菌株 5%的菌株 15 株继续复筛验 证。 初筛选出的 15 株菌株的复筛验 证效价均高于对照菌株 TMII15-21，其 中 51#、68#菌株分别高于对照 18.5%、 20.2%，且斜面外观正常，种子 液质量合格。因此，保留 51#、68#并进 行传代稳定性验证。 2.3 泰妙菌素生产菌高单位菌株 传代稳定性验证 将已选高单位菌株 51#、68#连续 传代至第五代，对其进行发酵摇瓶验证， 并利用 excel 进行 T-检验。 传代 后经发酵摇瓶验证，各代之间摇瓶效价 相差较小；同时，利用 excel 进行 T-检 验，各代之间的 P 值均大于 0.05，说明 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 各代之间无显著性差异；由此可见， 51#、68#高单位菌株遗传稳定性良好， 均可以作为生产菌株使用。 3 讨论与结论 利用等离子诱变技术，以泰妙生 产菌原生质体为诱变材料，对泰妙菌种 TMII15-21 进行诱变选育，通过筛选得 到两株泰妙高单位菌株：TMII17- 51、TMII17-68 。经发酵摇瓶验证，其 摇瓶效价分别高于出发菌株 18.5%、 20.2%。连续传代实验结果表明 其传代稳定性良好。 原生质体作为理想的诱变材料， 相对于菌丝体而言，其诱变效率明显提 高，该方法我们已经做了深入研究并能 熟练的操作，为后续工作提供了基础。 提高突变率。等离子诱变作为一种新型 的物理诱变技术，与传统的紫外诱变相 比，能够造成更加多样的 DNA 损伤， 正突变率