水稻稻瘟病菌单孢分离技术及常见问题分析

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 水稻稻瘟病菌单孢分离技术及常见 问题分析 摘要：水稻稻瘟病是由稻瘟菌 （Magnaporthe girsea）引起的一种真菌 性病害，可对水稻生产造成巨大损失。 稻瘟菌的频繁变异易导致抗病品种抗性 丧失，抗病育种家需每年对稻瘟菌变化 情况进行监测。如何快速有效获得纯化 菌株是监测稻瘟菌变化的前提。结合多 年实践经验，本文详细介绍了稻瘟菌单 孢分离技术以及分离过程中遇到的一些 常见问题。这些研究结果可以指导育种 家快速有效地获得纯化稻瘟菌。 中国论文网 /8/view-12869522.htm 关键词：稻瘟菌；单孢分离；常 见问题分析 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 中图分类号：S435.111.4+1 文献 标识号：A 文章编号：1001- 4942（2017）02-0132-04 由稻瘟菌（Magnaporthe grisea） 引起的水稻稻瘟病是水稻的首要病害1。 该病在水稻各个生长时期均可发生2， 其中穗颈瘟危害最为严重，直接影响水 稻的产量和质量。由于稻瘟病菌生理小 种容易发生变异，在抗病水稻品种对稻 瘟病菌的选择压力下，会导致田间稻瘟 病菌群的毒力基因组成发生变化，产生 新的致病小种，从而使抗病品种在种植 几年后丧失抗病性3，4 。这对于抗病 育种而言是个很大的挑战。育种家在关 注水稻品种（系）其他性状的同时，亦 要对每年的稻瘟菌生理小种动态变化进 行监测分析5，6 ，避免育成的水稻品 种（系）短时间内丧失抗瘟性。因此， 如何快速有效获得纯化菌株是育种家抗 病育种首先要面对的一个重要问题。 单孢分离是分离纯化稻瘟菌的常 用方法，具体就是每次只取稻瘟菌的一 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 个分生孢子，让它萌发成菌丝体来获得 纯菌株。目前常见的单孢分离方法主要 有挑针法、毛细管打孔法、眉毛挑针法 等7，但各有利弊。虽然国内对稻瘟菌 研究很多，但是对稻瘟菌单孢分离技术 的详细报道较少。本研究主要介绍利用 自制简易挑针进行稻瘟菌单孢分离的技 术以及分离过程中遇到的一些问题，以 期帮助育种家快速有效地获得纯化稻瘟 菌。 1 材料与方法 1.1 分离材料 病样采自山东临沂、滨州等地发 生穗颈瘟的稻田。 1.2 培养基配制 水琼脂培养基（WA）：琼脂 30 g，蒸馏水 1 000 mL，121高压蒸汽灭 菌 20 min，备用。 马铃薯蔗糖培养基（PSA）：去 皮马铃薯 200 g，煮沸 30 min，取滤液， 加入蔗糖 20 g，琼脂粉 20 g，加水定容 至 1 000 mL，121高压蒸汽灭菌 20 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 min，备用。 番茄燕麦培养基（TOA）：燕麦 片 30 g，加水煮沸约 20 min，用纱布滤 出燕麦汁。番茄榨汁后用纱布过滤，取 汁液 150 mL 倒入燕麦汁液中，加入琼 脂粉 20 g，定容至 1 000 mL，调节 pH 值在 7.0 左右，121高压蒸汽灭菌 20 min，备用。 1.3 病样处理 在超净工作台内将病样切成 1 cm 左右小段，放在无菌水中浸泡 10 min， 期间用镊子刮擦病样表面，初步去除表 面污物，之后在 75%乙醇中浸泡 60 s， 无菌水冲洗 60 s，移入有效氯含量 4% 的次氯酸钠溶液中浸泡 60 s， 然后无 菌水冲洗 3 次，每次 60 s。最后用无菌 滤纸吸干水分，置于 3% WA 培养基平 板上。28培养箱中培养 7 d 左右，直 至病样产生大量分生孢子。 1.4 简易挑针的制备 将常用的不锈钢昆虫针（规格 40 mm0.38 mm）插入并固定于 1 mL 蓝 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 色枪头前端，然后按照使用人习惯再套 入 34 个蓝色枪头，用于显微镜下挑 取分生孢子。 1.5 单孢分离 将培养 7 d 左右的病样放在超净 工作台内的 10 倍显微镜下观察，找到 产生的分生孢子。然后用制备的简易挑 针挑取多个分生孢子到 PSA 培养基上， 每个分生孢子之间保持一定距离。28 培养 12 h 左右，在 10 倍显微镜下将萌 发的分生孢子转移到新的 PSA 培养基 上培养，即可获得纯化的稻瘟菌。 1.6 分生孢子悬浮液的制备 参考刘任等8的方法制备分生孢 子悬浮液。将纯化的稻瘟菌接种到 TOA 培养基平板上，于 28培养 45 d。菌落直径约 5 cm 时，向培养皿内加 入 1 mL 无菌水，用接种环打碎菌丝， 吸取约 600 L 悬浮液接种到新的 TOA 培养基平板上，涂布均匀，自然晾干培 养基平板，于 28黑暗培养 3648 h。 待有一层致密的气生菌丝长出，用棉签 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 擦去气生菌丝，再用自来水洗去培养基 表面上残留的菌丝段与分生孢子，自然 晾干培养基，蒙上 2 层无菌纱布，于 28光照培养 3648 h 至有大量分生孢 子产生。用 0.025% （W/V） Tween 20 水溶液洗下分生孢子，即制成分生孢子 悬浮液。 1.7 产孢能力观察 取一滴分生孢子悬浮液于 40 倍 显微R 下镜检，观察纯化菌株的产孢 能力。 2 结果与分析 2.1 单孢分离 在超净工作台内的显微镜下观察， 可以看到培养 7 d 左右的病样产生的分 生孢子（图 1a） 。分生孢子成簇排列， 呈梨形，由两横隔分成三个细胞（图 1b） 。分生孢子萌发见图 1c。PSA 培养 基上生长 5 d 左右的稻瘟菌菌落直径约 为 45 cm，菌丝生长致密，菌落内侧 颜色呈深灰色，外侧颜色为灰白色（图 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 1d） 。 2.2 纯化菌株产孢能力观察 由于获得纯化菌株最终目的是为 了检测其致病性，因此需要对其产孢能 力进行观察。40 倍显微镜下镜检发现， 获得的纯化菌株可以产生大量分生孢子 （图 1e） 。调节悬浮液浓度至 40 倍镜下 每个视野有 50 个左右分生孢子（2105 个/mL）即可用于后续稻瘟菌接种试验。 a： 病样产孢情况，10 倍镜； b： 分生孢子梗及分生孢子形态，40 倍 镜； c： 分生孢子萌发，箭头所指为 菌丝，40 倍镜；d： 稻瘟菌菌落形态； e： 孢子悬浮液镜检， 40 倍镜。 2.3 单孢分离过程中的常见问题 2.3.1 有些孢子无法萌发或继续生 长获得纯化菌株的重要一环是挑取分生 孢子。笔者在试验中发现并非所有挑取 的分生孢子都能萌发，并且从病样上挑 取的已萌发分生孢子转移到 PSA 培养 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 基上，往往菌丝也不再继续生长。为了 查明原因，40 倍显微镜下观察发现这些 不能萌发或萌发后菌丝不再继续生长的 分生孢子的膈膜已经消失，内部的原生 质体形成了颗粒状囊泡，最后整个分生 孢子降解（图 2a、b） 。 笔者分 析认为 WA 培养基属于无营养培养基， 虽然利于诱发产生分生孢子，但是不能 提供孢子萌发或萌发后继续生长所需营 养，从而导致有些孢子无法萌发或继续 生长，启动了细胞程序性凋亡。 经过摸索，笔者采用震荡法，敲 击含有病样的培养皿，可促使刚成熟的 分生孢子从孢子梗上脱落下来，然后将 脱落的分生孢子挑取到 PSA 培养基上 进行萌发培养获得纯化菌落，大大提高 了试验效率。 2.3.2 菌株纯化后长期保存需冷冻 对于分离的稻瘟菌，可在 TOA 培养基 上短期保存；而长期保存需要将其冷冻 于-20 冰箱内。具体方法如下：将稻 瘟菌接种于铺满无菌滤纸片的 TOA 培 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 养基上，待菌丝覆盖滤纸片后，将滤纸 片放入无菌牛皮纸袋内，无菌操作台内 晾 12 h 左右，然后放入干燥器中 1 周， 最后放入-20 冰箱内保存。待需要制 备菌株接种前，取出滤纸片放置到 TOA 培养基上活化即可。-20冰箱内 长期保存稻瘟菌时，必须确保滤纸片干 燥，否则菌丝会失去活力，无法活化。 为保持干燥可将牛皮纸袋与变色硅胶一 起放入冰箱内。 2.3.3 常有污染菌混生在培养病样 时，发现常有一种污染菌会与稻瘟菌混 合生长（图 2c） ，在显微镜下观察该菌 外部形态初步确定为链隔孢（图 2d） ， 利用 rDNA-ITS 方法获得该菌序列后通 过 BLAST 比对后确认其为细极链格孢 （Alternaria tenuissima） （数据未公开） 。 细极链格孢可引起多种植物黑斑病9， 但并未在水稻上有所报道。同时，该菌 又是生物有益菌，对环境污染物具有较 强的降解作用且能产生具有抗病增产功 能的多种蛋白激发子9。对于该菌在病 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 样出现的原因，笔者推测其可能是稻瘟 病菌的拮抗菌，后续将继续研究。 a： 不能萌发的分生孢子，40 倍 镜；b： 萌发后不能继续生长的分生孢 子，40 倍镜； c： 污染菌，10 倍镜；d： 污染 菌孢子形态，40 倍镜。 3 讨论 山东地区属于温带季风性气候， 在水稻生长的中后期，低温阴雨或者多 雾天气发生频繁，易造成稻瘟病的暴发 流行。最近几年山东稻区稻瘟病大面积 发生，对水稻生产造成了较大损失10。 由于水稻新品种审定中对稻瘟病抗性差 的品种实行“ 一票否决” ，如果选育的农 艺性状优良的品种因为稻瘟病抗性差而 被淘汰，会严重降低育种工作效率。因 此掌握快速有效的稻瘟菌单孢分离技术， 对区域稻瘟菌进行监测分析，掌握生理 小种动态变化，及时调整育种材料，对 抗病育种工作很有必要。 获取纯化的稻瘟菌是及时掌握其 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 动态变化的前提，而利用简易挑针在显 微镜下进行单孢分离是最快捷有效的途 径，可消除多种稻瘟病菌混杂的可能。 在试验中笔者发现 WA 培养基适合诱导 稻瘟病菌产生分生孢子，但不适合分生 孢子萌发，而且并非所有萌发的分生孢 子都能够继续生长。通过震荡