实验性自身免疫性神经炎大鼠模型的制备与评价

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 实验性自身免疫性神经炎大鼠模型 的制备与评价 摘要 目的 探索实验性自身免 疫性神经炎（EAN）动物模型的建立和 相关指标的评价。 方法 将 20 只体重 140160 g 的 Lewis 雌性大鼠随机分为 EAN 组（ n = 10）和对照组（n = 10） ， 并对各组从 110 进行编号。EAN 组 采用 P0180-199 多肽免疫，对照组注射 生理盐水；免疫后观察 42 d，记录行为 学变化并评分；免疫后第 18 天检测两 组大鼠神经肌肉动作电位、坐骨神经电 镜组织学及免疫组织化学、腓肠肌 HE 染色等指标。 结果 EAN 组高峰期坐 骨神经复合动作电位传导速度低于对照 组，差异有统计学意义（P 中国论文网 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 /6/view-12962611.htm 关键词 实验性自身免疫性神经 炎；模型；脱髓鞘 中图分类号 R745.430.5 文献标 识码 A 文章编号 1673-7210（2017） 05（c）-0026-05 Abstract Objective To explore the establishment of experimental autoimmune neuritis （EAN） rat model and the evaluation of related indexes. Methods Twenty female Lewis rats weighing 140- 160 g were randomly divided into EAN group （n = 10） and control group （n = 10） ， and the number of each group was 1-10. The EAN group was immunized with P0180-199 peptide. The control group was injected with saline. After 42 days of immunization， the behavioral changes were recorded and scored. At the eighteenth days after immunization， the nerve-muscle action potential， sciatic nerve electronic microscope and -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 immunohistochemistry and HE staining of gastrocnemius muscle and other indicators of the rats in the two groups were detected. Results The sciatic nerve conduction velocity in the peak of the compound action potential in the EAN group was lower than that of control group， with statistically significant difference （P 0.05） ， and the amplitude was obviously lower than that of control group， with highly statistically significant difference （P 0.01） . The results of electron- microscope showed swell， honeycomb changes and miss out of myelin sheath， with an attenuation or disappearance of axon in the EAN group. The results of HE staining showed thinning of gastrocnemius-myofibers and stained cytoplasm and other degenerative changes in the EAN group. The results of immunohistochemistry showed that inflammatory factors Iba-1 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 （macrophage ） and CD3 （T cells） were increased in those with swell and miss out of myelin sheath. The axonal protein NF 200 was decreased in those with miss out of myelin sheath. The myelin protein S100 was decreased in those with honeycomb changes and miss out of myelin sheath. Conclusion The autoimmune neuritis model induced by the P0180-199 has high incidence and easy copy， and the pathological changes are close to clinical idiopathic neuritis. In this study， the evaluation indexes of EAN during peak hours provide a basis for the further study of the physiological process of this disease. Key words Experimental autoimmune neuritis； Model； Demyelination 实验性自身免疫性神经炎 （experimental autoimmune neuritis，EAN）是国际上公认的吉兰- 巴雷综合征（Guillian-Barre -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 syndrome，GBS）的经典动物模型，该 动物模型的建立对 GBS 自身免疫性机 制的假说起到了很大的支持作用1-4。 Waksman 等在 1955 年首次使用周围神 经匀浆在兔子身上建立了人类 GBS 模 型5。其后，研究者们通过纯化的外周 神经组织匀浆、髓鞘蛋白或合成多肽， 来诱导各种易感动物模型，也有研究者 将具有抗原特异性 T 细胞系静脉注入动 物体内，来诱导具有抗原特性的 EAN 模型6-7 ，其中最为广泛应用的是通过 外周神经匀浆、髓鞘蛋白或合成多肽诱 导的 Lewis 大鼠模型，例如采用 P0180- 199 配以不完全弗氏佐剂免疫8-9。 EAN 典型病理表现是 T 细胞和巨噬细 胞浸润，外周神经组织水肿及脱髓鞘 10-12，坐骨神经及腰髓神经根病理改 变最明显，而颈丛神经及颈髓神经根则 不明显7。1975 年 Allt13通过电镜对 兔 EAN 模型外周神经进行观察，发现 了髓鞘的两种变化：髓鞘蜂窝改变和髓 鞘脱失。对于坐骨神经组织水肿的病理 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 改变，Izumo 等14 曾通过神经内膜的 白蛋白和纤维蛋白原免疫组化的检测予 以证实，但没有更进一步细致的研究。 本研究观察 Lewis 雌性大鼠 EAN 模型 行为学、外周神经电生理、组织病理学 等各方面的变化，并重点研究外周神经 超微结构变化及分类，探讨其与炎症因 子、髓鞘蛋白、轴突蛋白间的联系，进 而探讨疾病形成机制。 1 材料与方法 1.1 实验动物 由于自身免疫性神经炎是一种短 时程自限性疾病，雌性 Lewis 大鼠性情 比较温顺，对于给药注射免疫应急反应 良好，所以采用健康纯系雌性 Lewis 大 鼠 20 只，68 周龄，体重 140160 g，并委托清华大学动物平台购自北京 维通利华（Vital River ）公司 合格证号： SCXK（京） 2014-0007，昼夜 12 h 交 替光照，自由摄食饮水，在室温 （202）条件下饲养，隔日更换垫料。 实验过程由清华大学动物伦理委员会审 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 核通过。 1.2 仪器与试药 P0180- 199（SSKRGRQTPVLYAMLDHSRS） 多肽购自安徽瀚海博兴生物技术有限公 司；不完全氟氏佐剂（Incomplete Freunds Adjuvant，IFA ）购自美国 Sigma 公司；结核分枝杆菌（H37Ra） 购自美国 DIfco 公司。台式离心机 （5424）购自 Eppendorf 公司；电生理 仪（RM-6240BD/CD 生物信号采集处理 系统 2.02 版）购自成都仪器厂；透射电 子显微镜（JEM-1200EX）购自 NIKON 公司（日本） ；激光共聚焦显微镜 （FV10i-oil）购自 Olympus 公司（日本） 。 1.3 造模与分组 健康纯系 Lewis 雌性大鼠 20 只， 按随机数字表随机分成两组，每组 10 只，EAN 组（P0180-199） ，对照组（生 理盐水） 。将 200 g P0180-199、1 mg H37Ra、100 L 生理盐水、 100 L IFA -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 混合液充分乳化，作为一只大鼠的注射 用量，注射入双后肢足底皮下（每只足 底 100 L） 。对照组注射生理盐水 100 L。老鼠腹腔注射 10%水合氯醛麻醉， 然后在两侧脚掌部位用 1 mL 注射器分 别打入 100 L 以上混合好的造模试剂 和对照组等量的生理盐水。造模成功的 标准主要看大鼠形态学上的变化，足底 发红肿胀，严重时出现溃疡，尾巴下垂 甚至拖地，后肢对于外界刺进反应迟缓 等因素结合考虑。 1.4 临床评分 免疫当天即第 0 天开始每天对两 组大鼠进行称重、行为学评分记录，一 直到免疫第 42 天时结束。评分标准， 正常：0 分；尾巴拖地或尾尖上翘：1 分；翻正反射受损：2 分；中度瘫痪： 3 分；重度瘫痪：4 分；四肢瘫痪或死 亡：5 分8。症状介于中间时评分值 0.5 分。 1.5 神经电生理 免疫第 18 天时每组大鼠各取 5 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 只，称重，腹腔注射 1%戊巴比妥钠按 照 3 mg/100 g，进行麻醉，放置刺激电 极、无关电极及记录电极。采用电生理 仪检测并记录神经-肌肉动作电位 （compound muscle action potentials，CMAPs） 。将检测数据代入 公式：CCV（ m/s）=刺激电极与记录电 极间的距离/传导时间，计算y 定部位 的 MNCV。 1.6 组织学观察 免疫第 18 天时取大鼠腓肠肌标 本，进行 HE 染色：冰冻切片固定 1530 s，稍水洗 35 s；苏木精液染 色（60）8 min；流水洗去苏木精液 5 min；1%盐酸乙醇 510 s，流水冲洗 30 s；促蓝液返蓝 510 s，流水冲洗 1530 s；伊红染色 50 s，蒸馏水稍洗 46 s；脱水，透明，中性树胶封固， 光镜观察。 1.7 透射电镜观察神经超微结构 免疫第 18 天时电生理检测后处 死大鼠，避开刺激电极接触部位，双侧 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 坐骨神经各取 1 cm 长神经，并固定于 2.5%戊二醛中。PBS 冲洗后经系列脱水， 无水乙醇，15 min，95%丙酮 15 min； 无水丙酮 10 min，5 min 换液 1 次。包 埋：将组织放入包埋剂氧化丙烯 （11）溶液中 1 h，纯包埋剂中 3 h。 超薄切片后用醋酸双氧铀及柠檬酸铅双 重染色。透射电子显微镜观察、摄片。 1.8 免疫组织化学 免疫第 18 天时从大鼠坐骨神经 根部取约 1 cm 长神经做免疫组化。免 疫组织化学染色标记大鼠坐骨神经 CD3（T 细胞） 、Iba-1（巨噬细胞） 、 S100（雪旺细胞） 、NF200（轴突细胞） 。 免疫荧光染色后用激光共聚焦显微镜分 析照相。 1.9 统计学方法 用 SPSS 17.0 软件进行数据处理，计量资 料数据以均数标准差（xs）表示，组 间比较采用两独立样本 t 检验。以 P 0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 2.1 模型鼠发病及评分情况 EAN 组大鼠从免疫第 1 天开始 出现不同程度的临床症状，包括精神不 振、皮毛不洁、双后足红肿、体重下降 等，免疫第 7 天时两组所有大鼠均出现 尾巴拖地行为，即行为学评分 1 分，提 示造模成功。第 1617 天瘫痪达到高 峰，第 18 天后逐渐缓解，高峰持续约 10 d，随后临床评分有所下降。EAN 组 和对照组临床评分结果见图 1。 2.2 神经电生理结果 EAN 组坐骨神经传导速度为 （19.694.47）m/s ，低于对照组 （30.982.71）m/s，差异有统计学意 义（P 0.05） ；EAN 组坐骨神经动作电 位振幅为（2.120.83）mV，明显低于 对照组（12.181.71）mV，差异有高 度统计学意义（P 0.01） 。见图 2。 2.3 组织学观察结果 对照组大鼠腓肠肌表现为胞膜完 整，胞质染色均匀，胞核位于细胞边缘， 肌纤维间的空隙较小。EAN 组大鼠腓 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 肠肌可见胞膜不完整，胞质染色变浅且 不均匀，胞核位于细胞中央甚至消失， 肌纤维变细、排列杂乱，空隙增大。见 图 3。 2.4 电镜结果 对照组：神经纤维髓鞘和轴索结 构正常，圆心轴索周围有层状髓鞘板层 结构包饶。EAN 组：髓鞘板层肿胀； 蜂窝状改变；髓鞘剥脱。见图 45。 2.5 免疫荧光化学结果 对照组：髓鞘紧密包饶在轴突外 层，轴突结构明显，有散在的炎症因子。 EAN 组： 髓鞘肿胀。髓鞘结构变粗， 有较多炎症因子。髓鞘剥脱。髓鞘结 构明显减少；轴突变细、减少，有较多 炎性因子。髓鞘蜂窝状改变。髓鞘结 构呈蜂窝状，炎症因子明显少。见图 68（封三、封四） 。 3 讨论 本研究采用大鼠进行模型试验， 相对于家兔实验容易操作，给药剂量容 易把控，在模型建立成功的基础上家兔 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 13 对于疾病的耐受较差，容易导致死亡。 评价方法方面大鼠在对于变态反应性方 面更加明显，拖尾程度也是重要的参考 标准之一。本研究使用 P0180-199 诱导 Lewis 雌性大鼠成功的造模，对以往文 献中使用 P0180-199 造模的过程加以验 证8， 15。采用单盲法观察，六级评分 法作为评分标准16-17 。EAN 组大鼠 免疫第 1 天开始出现不同程度的临床症 状，包括精神不振、皮毛不洁、双后足 红肿、体重下降等，类似于 GBS 发病 前的病毒感染症状18 ，与免疫原引起 全身免疫反应有关；免疫第 7 天时两组 大鼠均出现尾巴拖地行为，即行为学评 分 1 分，提