【毕业学位论文】（Word原稿）桑树细菌性枯萎病肠杆菌的鉴定、感病机制及其遗传多态性的研究

论文编号： 博 士 学 位 论 文 论文题目 桑树细菌性枯萎病 肠杆菌 的 鉴定、 感 病机制及其遗传多态性的研究 作者姓名 指导教师 教 授 研究员 学科 (专业 ) 植 物 病 理 学 所在学院 农业与生物技术学院 提交日期 2009 年 7 月 目 录 I 目 录 目 录 . I 摘 要 . 1 . 3 第一章 文献综述 . 5 1 桑树细菌性病害的研究 . 5 细菌性疫病（ . 5 青枯病（ . 6 枝软腐病（ . 7 叶日灼病（ . 7 细菌性叶斑病（ . 8 树植原体病害（ . 8 细菌性枯萎病（ . 8 2 肠杆菌与植物病害 . 9 杆菌科（ 概况 . 9 种引起植物病害的肠杆菌 . 12 癌肠杆菌（ E. . 12 沟肠杆菌（ E. . 12 解肠杆菌（ E. . 13 压肠杆菌（ E. . 14 . . 14 杆菌的分离鉴定 . 14 本分离及鉴定方法 . 15 病性测定 . 16 理生化鉴定方法 . 16 子生物学鉴定 . 17 杆菌在农业生产中的其他研究 . 21 物生防菌 . 21 物促生菌 . 21 物降解菌 . 22 物产氢菌 . 22 食品生产中的潜在危害 . 23 3 当前肠杆菌的研究热 点 . 23 杆菌作为生防菌和植物促生菌在作物中的定殖机制研究 . 23 物标记在肠杆菌与植物互作研究中的作用 . 24 物多样性和基因多态性研究 . 25 病害的报道 . 26 4 病害的检测和新病害报道 . 26 5 研究的背景及研究内容 . 30 第二章 引起桑树细菌性枯萎病病原菌的分离和鉴定 . 错误 !未定义书签。 引 言 . 错误 !未定义书签。 1 材料和方法 . 错误 !未定义书签。 害调查，样品采集及致病性鉴定 . 错误 !未定义书签。 状观察及其描述 . 错误 !未定义书签。 目 录 样品的采 集及其病原菌的分离纯化和保存 . 错误 !未定义书签。 原菌的致病性鉴定 . 错误 !未定义书签。 态及基本生理生化特性鉴定 . 错误 !未定义书签。 态观察 . 错误 !未定义书签。 它生理生化特性 . 错误 !未定义书签。 5 种碳源利用鉴定 . 错误 !未定义书签。 生素抗性鉴定 . 错误 !未定义书签。 生素选用 品： . 错误 !未定义书签。 同浓度抗生素溶液制备 . 错误 !未定义书签。 试菌 /培养基混液准备 . 错误 !未定义书签。 片法对测试菌的抗生素敏感性测定 . 错误 !未定义书签。 细胞脂肪酸鉴定 . 错误 !未定义书签。 剂、仪器及分析软件 . 错误 !未定义书签。 肪酸的提取过程： . 错误 !未定义书签。 肪酸的检测 . 错误 !未定义书签。 6S 合酶基因（ 序列测定 . 错误 !未定义书签。 剂和仪器 . 错误 !未定义书签。 菌 提 . 错误 !未定义书签。 增 . 错误 !未定义书签。 2 结果与分析 . 错误 !未定义书签。 树细菌性枯萎病 病害症状描述 . 错误 !未定义书签。 间症状描述 . 错误 !未定义书签。 种症状描述 . 错误 !未定义书签。 茄组培苗致病性测定 . 错误 !未定义书签。 树细菌枯萎病病原菌的特征 . 错误 !未定义书签。 态观察 . 错误 !未定义书签。 它生理生化和 源利用特性鉴定 . 错误 !未定义书签。 生素抗性鉴定 . 错误 !未定义书签。 细胞脂肪酸鉴定结果 . 错误 !未定义书签。 个基因序列的鉴定结果比较 . 错误 !未定义书签。 6S 因序列分析 . 错误 !未定义书签。 合酶基因（ 序列鉴定 . 错误 !未定义书签。 3 讨 论 . 错误 !未定义书签。 树细菌性枯萎病的定义 . 错误 !未定义书签。 . 错误 !未定义书签。 列分析 . 错误 !未定义书签。 4 本章小结 . 错误 !未定义书签。 第三章 标记桑枯萎肠杆菌 研究 . 错误 !未定义书 签。 1. 材料与方法 . 错误 !未定义书签。 致病菌株的 基因标记 . 错误 !未定义书签。 株、质粒及培养基 . 错误 !未定义书签。 剂及仪器 . 错误 !未定义书签。 (感受态细胞的制备 . 错误 !未定义书签。 粒提取 . 错误 !未定义书签。 (的电击转化 . 错误 !未定义书签。 性转化子的荧光检测 . 错误 !未定义书签。 目 录 记菌的 测及 序列测定 . 错误 !未定义书签。 落 对标记菌的 因进行检测 . 错误 !未定义书签。 记菌的验证 . 错误 !未定义书签。 记菌的特性研究 . 错误 !未定义书签。 落形态和菌体形态观察 . 错误 !未定义书签。 式细胞仪检测 . 错误 !未定义书签。 记对菌株生长的影响 . 错误 !未定义书签。 记菌株 达稳定性 . 错误 !未定义书签。 记菌株 致病性 . 错误 !未定义书签。 记菌在感病植株体内的定殖研究 . 错误 !未定义书签。 始菌和 记菌在桑树体内的增殖 . 错误 !未定义书签。 始菌和 记菌在番茄组培苗体内的增殖 . 错误 !未定义书签。 记菌在番茄组培苗组织细胞寄生能力的观察 . 错误 !未定义书签。 2 结果分析 . 错误 !未定义书签。 2.1 因双标记肠杆菌 . 错误 !未定义书签。 性转化子的荧光检测 . 错误 !未定义书签。 性转化子的 定 . 错误 !未定义书签。 记菌的 16S 因部分序列分析 . 错误 !未定义书签。 记菌的特性研 究 . 错误 !未定义书签。 落形态和菌体形态观察 . 错误 !未定义书签。 记对菌株生长的影响 . 错误 !未定义书签。 记菌株 达稳定性 . 错误 !未定义书签。 记菌株 致病性鉴定 . 错误 !未定义书签。 记菌在感病植株体内的定殖研究 . 错误 !未定义书签。 原菌在桑树体内的增殖 . 错误 !未定义书签。 原菌在番茄组培苗体内的增殖 . 错误 !未定义书签。 记菌在桑树和番茄组培苗组织细胞寄生能力的 观察 错误 !未定义书签。 3 讨论 . 错误 !未定义书签。 4 本章小结 . 错误 !未定义书签。 第四章 桑树肠杆菌枯萎病的多态性研究 . 错误 !未定义书签。 1 材料与方法 . 错误 !未定义书签。 株的收集及保存 . 错误 !未定义书签。 病能力多态性分析 . 错误 !未定义书签。 通烟草过敏性反应鉴定 . 错误 !未定义书签。 树致病能力测定 . 错误 !未定义书签。 它作物的 致病性测定 . 错误 !未定义书签。 姜块茎和洋葱球茎致病性测定 . 错误 !未定义书签。 肪酸多态性分析 . 错误 !未定义书签。 增和序列分析 . 错误 !未定义书签。 因组 制备 . 错误 !未定义书签。 增体系 . 错误 !未定义书签。 据分析 . 错误 !未定义书签。 2 结果分析 . 错误 !未定义书签。 敏性反应测定 . 错误 !未定义书签。 桑树离体培养枝条的致病力 . 错误 !未定义书签。 肪酸多态性分析 . 错误 !未定义书签。 目 录 树枯萎病基因多态性分析 . 错误 !未定义书签。 它作物致病力 . 错误 !未定义书签。 3 讨论 . 错误 !未定义 书签。 4 本章小结 . 错误 !未定义书签。 结论与展望 . 错误 !未定义书签。 一 结论 . 错误 !未定义书签。 二 展望 . 错误 !未定义书签。 参考文献 . 错误 !未定义书签。 致 谢 . 错误 !未定义书签。 附录 博士期间论文发表情况 . 错误 !未定义书签。 附录 片与表格 . 错误 !未定义书签。 摘 要 1 摘 要 从 2004 年开始桑树细菌性枯萎病在浙江省临安、桐庐等地桑树大面积发病，造成了严重的损失。 2006 年本研究通过考察，取样，分离病原菌，运用传统植物病原细菌学的鉴定方法，通过 柯赫氏法则 验证了细菌为该病的病原菌，然后依次通过生理生化检测、 95 种碳源的利用特征、全细胞脂肪酸鉴定、 16S 因序列分析，证明了引起浙江省桑树枯萎病的病原菌为阴沟肠杆菌菌群 次，为验证病原菌引起病害发生的机制，本研究通过对主要致病菌导入绿色荧光蛋白基因的方法，观察了病原菌在植物体内的分布情况；最后，通过脂肪酸特征、基因间重复序列多态性和特殊基因序列遗传多态性的研究比较，分析了病原菌的群体多态性特征。取得了以下主要研究结果： （ 1）从浙江省临安和桐庐发病重的桑园分三次采样共 33 份，分离到病原细菌 98 株。对选取的 6 个代表性菌株进行 柯赫氏法则 验证，分别采用水培养和桑树盆栽苗接种的方法确定了 6 个菌都能单独引起桑树枝条产生叶片黄化、枯萎、落叶和枝条顶端坏死症状；引起桑树盆栽苗产生枯萎和维管束褐变症状，为典型的桑树细菌性 枯萎病病原菌。 碳源利用鉴定表明 6 个代表性测试菌与阴沟肠杆菌 E. 配率为 脂肪酸鉴定则以 平均相似性匹配为 生癌肠杆菌 E. 肪酸聚类和 16S 列分析都将 6 株病原菌分配到3 个肠杆菌种中，但是三个种之间的序列相似性也都高于 97%；最后通过 个菌分别定位到阴沟肠杆菌 E. 氏肠杆菌 E. 属于阴沟肠杆菌组群（ （ 2）用电击转化的方法将带有绿色荧光蛋白和荧光素酶 标记基因 的 座载体 整合到桑树细菌性枯萎病病原菌代表性菌株，利用荧光显微镜观察 因表达后发强绿色荧光的菌体，得到一个高效表达 标记菌 过 因的特摘 要 2 异性引物扩增，菌落形态的观察，流式细胞仪检测菌体大小、形状及荧光的表达量，以及 16S 列分析证明了标记菌株的确为原 始菌株 化标记基因后的衍生菌。而且标记菌的荧光表达量比质粒宿主菌要高且稳定，证明 次标记菌生长的代时比原始菌缩短了 22%，表明插入基因一定程度上加快了细菌的生长速度。 接种实验表明标记菌和原始菌对桑树和番茄组织培养苗都具有致病能力，但是标记菌引起桑树苗发病症状比对照晚了 5，表明外源基因的表达削弱了菌株的致病力表现。但是根据平板分离筛选和荧光标记对照标记菌和原始菌在桑树体内分布的情况：为侧枝最高，叶片最低，主茎和根部居中，随着病害的扩展，各部分的菌量 分布曲线都呈波浪形变化，接种一个月后，侧枝和叶片上的菌量数都会上升。相比较之下，病原菌在番茄组培苗的发病时间较短，接种早期病原菌的菌量分布为根部最高，茎部次之，叶片最低。表明，外源基因的转入对不影响菌株在寄主体内的增殖生长。 （ 4）通过共聚焦荧光显微镜观察肠杆菌在植物根、茎、叶组织分布的情况表明：细菌主要通过定殖于维管束组织的导管，堵塞导管水分的运输导致植株萎蔫。在接种 3 天后，番茄组培苗根茎部分的导管组织可以清楚的观察到大量发绿色荧光菌体的分布，根部生长点和分生组织细胞组织也能观察到菌体，但是不能够检测到植 株叶片上的菌体分布情况，说明植物上部出现枯萎，顶端坏死症状是由于细菌堵塞导管，引起植物水分缺乏导致的。 （ 5）引起桑树枯萎病的阴沟肠杆菌组群是一个条件致病群体，可通过 列多态性和 因序列聚类分为 10 个基因群，但是它们的多重遗传结构与病原菌致病能力和致病范围多态性之间不存在相关性。本实验使用了常用的几种方法对肠杆菌的多态性进行分析，结果表明 2种基因间重复序列扩增多态性（ 2 个特殊基因（ 0，态性都和菌 株的来源相关，但是与菌株间的脂肪酸类型和致病能力方面不存在的相关性。表明了控制肠杆菌细胞脂肪酸类型的基因和控制病原菌致病相关基因可能不存在于肠细菌基因间共有重复序列和 件中，而控制细菌热休克蛋白的基因和 编码 基因也与编码细胞脂肪酸类型和致病性基因没有直接关系。但是 这四种基因遗传多态性的研究可对肠杆菌的种下分化鉴定和推测病原菌的来源及其病害的传播流行趋势起到指导性作用。 肠杆菌是一种条件致病菌，广泛存在于多重生态系统中，包括植物根围、摘 要 3 植物体内、水、土壤、动物、人体，及其的生活环境。到目 前为止，由肠杆菌引起的植物病害报道不多，但是寄主多达十余种，但是由肠杆菌引起木