狗脊多糖对硝普钠诱导退变大鼠软骨细胞氧自由基影响的研究

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 狗脊多糖对硝普钠诱导退变大鼠软 骨细胞氧自由基影响的研究 1.86%，表明仪器精密度良好，且稳定 性试验 RSD = 1.98%，平均回收率试验 为 95.4%，RSD = 1.83%；酶联免疫吸 附法检测经 SNP 造模后软骨细胞氧自 由基表达结果显示，与空白对照组比较， 模型对照组 SOD、NO、MDA 含量表达 差异均有统计学意义（P 中国论文网 /1/view-13043656.htm 【关键词】 骨关节炎，膝；狗 脊多糖；软骨细胞；氧自由基；大鼠 【ABSTRACT 】Objective：To observe the effects of Rhizoma Cibotii polysaccharides on oxygen free radicals in -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 rats degenerative chondrocytes induced by sodium nitroprusside（SNP）and provide a theoretical basis for its clinical application in osteoarthritis.Methods：Polysaccharide was extracted and purified with water extraction and Sevag methods，and the polysaccharide content was determined by the phenol sulfuric acid colorimetry.The enzyme linked immunosorbent assay was used to detect the contents of superoxide dismutase（SOD） ，nitric oxide（NO） and malondialdehyde（MDA） respectively in the blank group，the model group and the Rhizoma Cibotii polysaccharides group（ 100，200，400，800 g mL- 1）.Results：The Rhizoma Cibotii polysaccharide content was 76.91% and the precision experiment showed RSD = 1.86%， which showed that the precision of the instrument was good.The stability -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 test showed RSD = 1.98%，the average recovery test was 95.4%，and RSD was 1.83%.The enzyme linked immunosorbent assay showed that the differences between the contents of SOD，NO and MDA in the model group and thosein the blank group were statistically significant（P 0.01） ，suggesting that the chond-rocyte degeneration model was established.Compared with the model group， after the intervention to the experimental group（ 100，200，400，800 g mL- 1）for 48 h， the contents of SOD could be up regulated and the content of NO and MDA could be down regulated，with the group of 200 ?g mL-1 the most significant（P 0.01）.Conclusion ：The phenol sulfuric acid colorimetry can be used to determine the content of the Rhizoma Cibotii polysaccharide.Rhizoma Cibotii polysaccharide can reduce the -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 expression of the abnormal oxygen free radical content in the chondrocytes after the SNP model，up-regulating the level of antioxidant factors and playing an antioxidant role. 【Keywords 】 osteoarthritis， knee；Rhizoma Cibotii polysaccharide；chondrocytes；oxygen free radicals；rats 膝骨关节炎 （knee osteoarthritis，KOA）是一种主 要由生物学因素及力学异常影响下导致 关节软骨渐进退变的慢性关节疾病。目 前，在全球范围内 KOA 发病形势严峻， 患病人口众多，其临床常以关节部位的 疼痛、关节僵硬等症状伴随始终，具有 很高的致残率1-3。鉴于当前缺乏从根 本上治疗和延缓病程的有效手段，因此， 寻找一种安全、适用、便捷的治疗方法 是今后治疗追求的目标。中医学对 KOA 的治疗认识古已有之，治疗方法 丰富多样，具有较高安全性、方便经济 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 特点，且临床具有良效4。鉴于 KOA 的根本病机是本虚标实，因此，施以补 肾柔肝，兼以祛风、除湿作用的中药， 方切合其治则5。 近年来，研究发现中药多糖可有 效抑制 KOA 的发生和发展，中药多糖 能够改善局部微循环，降低骨内压、改 善滑膜炎症、调节异常细胞因子含量表 达及发挥对软骨细胞凋亡的抑制作用， 从而可在一定程度上有效抑制 KOA 的 发生和发展6。而狗脊多糖是从中药狗 脊中提取的活性物质，前期研究发现， 其对软骨细胞活性具有正向调控作用7。 因此，本研究进一步研究其对 SNP 诱 导大鼠软骨细胞退变模型氧自由基的影 响，为探讨其作用机制提供实验依据。 1 实验材料 1.1 实验动物和药物 健康 SD 雄 性大鼠 16 只（清洁级） ，体质量约为 90 g，饲养环境终年维持温度 2325 ， 湿度 55%60%，每小时换风 16 次， 12 h 光照/12 h 黑暗自动控制循环光照条 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 件。上海斯莱克实验动物有限责任公司 提供，许可证号：SCXK（沪）2007- 0005。制狗脊由福建省尤溪仙锦药业有 限公司提供。 1.2 主要试剂 D-无水葡萄糖 （中国食品药品检定研究院，批号 110833-201104） ；磷酸盐缓冲液（美国 HyClone 公司，批号 NZM1284） ； DMEM/LOW GLUCOSE（美国 HyClone 公司，批号 NZK1239） ；SOD 试剂盒（南京建成生物工程研究所，批 号 20140606） ；NO 试剂盒（南京建成 生物工程研究所，批号 20140528） ； MDA 试剂盒（南京建成生物工程研究 所，批号 20140527）等。 1.3 主要仪器 旋转蒸发仪（上海 亚荣生化仪器厂） ；紫外分光光度计 （岛津公司） ；Bio-tek 酶标仪（美国 Bio-Tek 公司） ；低温高速离心机（美国 BECKMAN，64R 型） ；无菌操作台 （苏州安泰空气技术有限公司， AIRTECH 型） 。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 2 方 法 2.1 狗脊多糖的提取 Q 取狗脊 药材 50 g，依次经粉碎、筛检、脱脂 （石油醚） ，提取 1 次，提取 2 次（均 为 10 倍体积蒸馏水/次/2 h） ，收集提取 液 2 次，抽滤减压，浓缩体积至 300 mL，后入乙醇（3 倍体积）静置过夜。 次日依次经离心沉淀，干燥凝集（初获 粗多糖） ，Sevag 法（筛除蛋白成分） ， 950 mL L-1 乙醇分级沉淀，高速离 心收集沉淀，洗涤（依次使用无水乙醇、 丙酮、乙醚） ，经低温干燥即为狗脊多 糖。 2.2 苯酚-硫酸比色法检测狗脊多 糖的含量 2.2.1 最大吸收波长的选择 先以 50 mL 蒸馏水为母液，混匀溶解准确称 取的无水葡萄糖 0.01 g，重复上一步操 作并以蒸馏水：无水葡萄糖为 25 mL0.01 g 的量值再次配制其混合液， 此即为葡萄糖标准液。然后混匀含有 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 0.1 mL（100 L）葡萄糖标准液及 0.9 mL（900 L）蒸馏水的混合液，依次加 入 1 mL 质量分数为 5%的苯酚、5 mL 浓硫酸后置于沸水 15 min，冰水 15 min 反应，经紫外分光仪检测确定其最大吸 收峰值波长。 2.2.2 葡萄糖标准曲线的制作 依 次精密吸取葡萄糖标准液 0.1，0.3，0.5，0.6，0.7，0.9，1.0 mL 后分别加入 7 支试管中，加水稀释至 1.0 mL，依 次加入 1 mL 质量分数为 5%的苯 酚、5 mL 浓硫酸后反应 30 min。对比 检测空白对照组（蒸馏水） 、葡萄糖标 准液组在 490 nm 波长时的吸光度值 （OD） ，分别以吸光度值 A 和葡萄糖质 量分数 C（mg mL-1）为纵横标位， 绘制标准曲线方程。 2.2.3 狗脊多糖的含量测定 先以 50 mL 蒸馏水为母液，混匀溶解准确称 取的狗脊多糖粉末 0.01 g，重复上一步 操作并以蒸馏水无水葡萄糖为 25 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 mL0.01 g 的量值再次配制其混合液， 此即为狗脊多糖供试液。取供试液 1.0 mL，依次加入 1 mL 苯酚（质量分数 5%） 、 5 mL 浓硫酸反应后经比色检测其吸光 度 A，则狗脊多糖浓度 C 即可由标准曲 线方程计算得出。 2.3 软骨细胞的分离和培养及鉴 定 2.3.1 软骨细胞的分离和培养 其 步骤依次为：人工处死大鼠每次 3 只 （经行脱颈锥式） ，浸泡消毒；离断至 双侧膝关节以上骨骼，PBS 缓冲液冲洗 净，再次浸泡消毒；暴露关节腔，按层 次分离关节软骨，集中后经剪碎处理 （1 mm3/单位体积） ，PBS 缓冲液冲洗 3 遍及以上，质量分数为 0.2%型胶原 酶消化，无菌试管收集消化后的上清液 （每次 2 h，重复 3 次） ，高速离心后弃 上清液；移液器代液（细胞培养液）状 态轻柔吹打沉淀，计数板计数（2105 mL-1） ，种植原代细胞于培养瓶进行 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 孵化培养；48 h 后初次换液，镜下观察 细胞铺满绝大数瓶底面积，PBS 缓冲液 冲洗倒净，胰酶消化进行传代培养，此 时标为第 1 代软骨细胞。以同样方法传 至第 3 代细胞，镜下观察比较分析后， 选取状态及活性最佳的第 2 代软骨细胞 进行后续实验。 2.3.2 软骨细胞鉴定 甲苯胺蓝染 色法：使用经高压蒸汽消毒后的齿镊轻 柔夹持无菌盖玻片转移至 6 孔板孔中央 部，以其为载体培育软骨细胞（计数 2500 个 mL-1） ，待爬片后，冲洗 （PBS）3 遍；固定 30 min（质量分数 为 4%中性多聚甲醛） ，再次冲洗 （PBS）3 遍；染色（1%甲苯胺蓝）10 min，第 3 次冲洗（PBS）3 遍；漂洗至 无深蓝色（蒸馏水） ，再漂洗（无水乙 醇）1 次，常温风干后封片，观察与鉴 定（光学显微镜） 。型胶原免疫组织 化学染色：使用经高压蒸汽消毒后的齿 镊轻柔夹持无菌盖玻片转移至 6 孔板孔 中央部，以其为载体培育软骨细胞（计 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 数 2500 个 mL-1） ，待爬片后，冲洗 （PBS）3 遍；固定 30 min（质量分数 为 4 %中性多聚甲醛） ，再次冲洗 （PBS）3 遍；裂解（质量分数为 0.1 % 破膜剂 50 L） 20 min，第 3 次冲洗 （PBS）3 遍；50 LH2O2（质量分数 为 3 %）反应 20 min，第 4 次冲洗 （PBS）3 遍；封闭（质量分数 5 % BSA）30 min 后，阳性组一抗反应过夜 （型胶原 1200） ，阴性组用 PBS 代 替，第 5 次冲洗（PBS）3 遍；50 L体 积二抗（羊抗兔 1200）反应 30 min，第 6 次冲洗（PBS）3 遍；DAB 浸润玻片（每次 50 L）反应 10 min， 流水漂洗 3 遍（每次 5 min） ，苏木素复 染，第 7 次冲洗（PBS）3 遍；迅速返 蓝（质量分数为 5 %盐酸乙醇溶液）2 s，常温晾干，梯度酒精脱水，二甲苯 透明梯度，封片（中性树脂） ，观察与 鉴定（光学显微镜） 。 2.4 退变 软骨细胞模型的复制 选取第 2 代软骨 细胞，经计数后，调整细胞悬液计数为 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 2104 mL-1，使用移液枪将其接种于 洁净培养瓶（4 mL） ，放置于 37 培养 箱中（体积分数为 5%的 CO2）进行孵 育细胞，每隔 24 h 更换 1 次培养液，待 软骨细胞沿瓶壁生长占满约 90%的空间 时，按本课题组前期造模方式7，加入 1 mM SNP 干预软骨细胞 24 h 后成模。 2.5 酶联免疫吸附法测试 SOD、NO、MDA 的含量 选取第 2 代 软骨细胞，按每孔 1105 个 mL-1 的 密度接种于洁净 6 孔板，设置空白对照 组、模型对照组、狗脊多糖M。空白 对照组：向每孔加入 DMEM（体积分 数为 10 %的胎牛血清） 2 mL 培养 24 h 后，换新每孔 2 mL 的 DMEM 液依次加 入后继续培养 48 h。模型对照组：每孔 中加入 1 mM（1000 ng mL-1）SNP 的培养基 2 mL 作用 24 h 后，更换新含 10 %胎牛血清的 DMEM 2 mL 继续培养 48 h。狗脊多糖组：孔中加入剂量为 1 mM（1000 ng mL-1）的 SNP 的培养基 2 mL 作用 24 h 后更换为 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 13 不同质量分数的狗脊多糖 2 mL（100，200，400，800 g mL- 1） DMEM 继续培养 48 h（狗脊多糖 的最佳时效-量效关系为 48 h 与 200 g mL-1，依据前期研究7 ） 。将各组细 胞液收集到离心管，离心机以 1500 r min-1 离心 2 次后收集上清液，依实 验所需进行分装后储存于-80 冰箱备 用。按照各指标试剂盒说明书，其中 NO、SOD、MDA 的定量检测分别以硝 酸还原酶法、黄嘌呤氧化酶法（羟胺法） 、硫代巴比妥法（TBA）进行操作。 2.6 统计学方法 采用 SPSS 19.0 软件进行统计分析。计量资料以表示， 2 组间比较采用 t 检验与单因素方差分 析；计数资料采用 2检验。以 P 0.05 为差异有统计学意义。 3 结 果 3.1 苯酚-硫酸比色法测定结果 3.1.1 最大吸收波长的确定 制备 标准品溶液与空白对照组溶液，操作如 前，经紫外线 200800 nm 范围内检测， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 14 结果表明最大吸收波长为 484 nm。 3.1.2 葡萄糖标准曲线绘制 标准 曲线回归方程为：Y = 0.0672 X + 0.0157，R2 = 0.9994，说明葡萄糖在 111 g mL-1 范围内线性关系良好。 3.1.3 精密度、稳定性及加样回 收率试验 精密度试验：精密吸取标准 品溶液 0.5 mL，加蒸馏水至 1.0 mL，按 苯酚-硫酸法操作在最大吸收波长处平 行测定 6 次，A 值分别为 0.443 8，0.432 9，0.439 6，0.442 9，0.438 2，0.422 0，RSD = 1.86%，表明仪器精 密度良好。稳定性试验：精密吸取标准 品溶液 0.5 mL，加蒸馏水至 1.0 mL，按 苯酚-硫酸法操作，在最大吸收波长处 每隔 30 min 测 1 次，共测 6 次，A 值分 别为 0.423 6，0.432 3，0.419 6，0.421 9，0.409 2，0.412 0，RSD = 1.98 %。 加样回收率试验：取样品溶液 6 份，每 份均为 0.4 mL，依次向每份溶液中加入 葡萄糖标准品溶液 0.3 mL，加入蒸馏水 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 15 至 1 mL，按苯酚-硫酸法操作，于 484 nm 处测定其吸光度，计算平均回收 率为 95.4 %，RSD = 1.83%。 3.1.4 狗脊多糖样品含量测定 取 供试液 1.0 mL，使用移液枪加入质量分 数为 5 %的苯酚 1 mL 进行混匀，再迅 速紧贴管壁滴加 5 mL 浓硫酸，经缓慢 振荡混匀，比色检测吸光度 A，由回归 方程求出经 Sevag 法除蛋白后的狗脊多 糖含量为 76.91%。 3.2 软骨细胞形态学特征及鉴定 3.2.1 软骨细胞形态学特征 镜下 观察细胞外观形态近似圆形，大小基本 一致，且遮光性强为原代软骨细胞；接 种 24 h 后大多数软骨细胞开始紧贴壁生 长，形似扁平状，胞浆丰富，胞核清晰， 具有 12 个核仁，见图 1（1） ；培养 3 d 后，软骨细胞开始聚集重叠并沿瓶壁 扩散生长，呈现“ 簇团样”集聚，外观以 圆形或椭圆形为主，见图 1（2） ；5 d 后 细胞分布均匀，边界清晰，形态结构一 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 16 致，呈明显的铺路石状外观，见图 1（3） ；本实验使用第 2 代软骨细胞因 其生长状态良好，细胞分泌基质的能力 较强，增殖速度较快，见图 1（4） 。 3.2.2 甲苯胺蓝染色及型胶原 免疫组化鉴定结果 经甲苯胺蓝染色后， 正常软骨细胞镜下显示其细胞核被染成 蓝色，细胞间质及胞浆均被染成紫红色； 经型胶原染色后，阴性组胞浆区颜色 透明，阳性组胞浆区为棕黄色，由上可 鉴定本实验所用细胞为软骨细胞。见图 2。 3.3 酶联免疫吸附测定法测试 SOD、NO、MDA 含量结果 200 g mL-1 狗脊多糖作用于 1mM SNP 造模后 的软骨细胞，可通过上调 SOD 含量表 达，同时下调 NO、MDA 含量表达。与 空白对照组比较，模型对照组差异有统 计学意义（P 0.01） ，提示软骨细胞在 一定程度上发生退变，软骨细胞退变模 型建立；与模型对照组比较，各剂量狗 脊多糖组差异均有统计学意义（P -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 17 0.05 或 P 0.01） ，提示狗脊多糖可通过 改善退变模型软骨细胞氧自由基表达来 发挥抗氧化作用，进而在一定程度上延 缓软骨细胞的凋亡进程。见表 1 和图 3。 4 讨 论 4.1 狗脊多糖切合 KOA 的中医 治疗病机 从中医辨证论治的角度看， KOA 属“膝骨痹 ”范畴，其病机多为肝肾 不足引起筋骨失养，外加风寒湿邪流注 经络，困乏关节，致使气血运行受阻， 引起关节活动受限，即其病位在“肝肾” ， 然病在“筋骨 ”，故对其治疗的根本