重金属铅诱发机体氧化应激效应的研究进展

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 重金属铅诱发机体氧化应激效应的 研究进展 摘要：尽管各国政府已经采取多 项措施限制和减少铅的使用，铅污染引 发的健康问题依旧非常突出，仍是当前 社会高度关注的环境污染与健康问题之 一。研究表明，氧化应激是几乎所有疾 病发生的诱因，而且铅类污染物对生命 体的危害与氧化应激效应密切相关。铅 暴露使机体产生过量的活性氧物质导致 体内氧化还原平衡态被打破，造成蛋白 质、核酸、脂类等生物大分子的氧化损 伤，从而导致细胞凋亡或坏死和组织器 官代谢紊乱，引发机体病变甚至癌症的 发生。因此，有必要从生物大分子、细 胞和实验动物三个层面系统综述铅暴露 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 诱发机体氧化损伤的作用机理，阐述重 金属铅诱发机体氧化应激效应的研究进 展。 中国论文网 /4/view-12831936.htm 关键词：重金属铅；氧化应激； 毒性效应 中图分类号：Q89 文献标识码： A Abstract：Lead still possesses great threats to human health owing to its widespread distribution in the environment caused by human activities， although various actions have been taken to cut down the use and distribution of lead by the governments. Abundant evidence has indicated oxidative stress is a trigger of many varied diseases， which has still been one of the biggest concerns on environmental pollution and health. Multiple studies have shown that lead toxicity is related to oxidative stress because it generates reactive oxygen -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 species （ ROS） ， interferes with antioxidant enzyme activities， and breaks the balance of the pro- oxidant/antioxidant defense system， resulting in oxidative damage of proteins， nucleic acids and lipid compounds， cell apoptosis and necrosis， and metabolic disorders of tissues and organs of humans， and causes harmful diseases or cancers. Therefore， it is of great importance to review mechanisms of oxidative damage caused by lead combined at the molecular， cellular and organismal levels to understand harmful effects of lead exposure to human health. Keywords ： lead； oxidative stress； toxic effects 2015 年 11 月下旬，国家环保部 公布的重金属污染综合防治“十二五” 规划2014 年度考核结果显示，尽管国 家重点监控的重金属污染物（铅、汞、 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 镉、 铬和类金属砷）减排成效显著， 但由于涉重金属产业的快速扩张造成重 金属污染物排放总量仍处于高位水平， 重金属环境风险隐患依然突出。根据美 国地质调查局（United States Geological Survey）最新公布的 2014 年全球铅行 业市场分析数据，中国依然是精铅产量 和消费量最多的国家，均远远高于欧洲 （第二位）和美国（第三位）之和。巨 大的铅消耗量中仅有约 1/4 的铅被回收 再利用，其余大部分以“ 三废 ”形式排入 环境介质中，经食物链传递或呼吸道等 途径进入人体并蓄积于肝脏、肾脏等靶 器官中，进而侵入组织细胞诱发氧化应 激、细胞凋亡等毒性作用损伤其生理功 能。因此研究铅污染治理及铅污染引发 的健康问题，已经成为环境污染与健康 领域亟需解决的重要科学问题。本论文 从动物水平、细胞水平和功能大分子水 平系统综述铅暴露诱发氧化应激效应与 机理的研究进展，为开展铅污染损伤人 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 体健康的早期预警及防治技术提供借鉴。 1 铅引发的毒性效应及与氧化应 激的关系 1.1 铅的毒性作用简介 铅是地壳中含量最多的重金属元 素。由于铅具有密度大，柔软性，耐腐 蚀，延展性强等特点，在古代就有广泛 应用。在古罗马时代就有铅制作的水管 和酒器；我国在各个朝代都有使用铅制 作的钱币。铅以工业规模生产和开发是 19 世纪才开始的，在 19 世纪中叶炼铅 工业获得迅猛发展。据统计目前铅在有 色金属生产中占第四位2。在工业开采、 加工和制作过程中，铅会通过水、空气、 食物链等途径与人类和动物体广泛接触， 进而通过消化道、呼吸道和皮肤等吸收 进入机体3。进入消化道的铅（吸收率 仅为 1%-2%，婴幼儿吸收率较高，钙缺 乏可提高吸收率）主要在十二指肠吸收， 经门静脉到达肝脏，一部分进入血液循 环，一部分由胆汁分泌进入肠道，而后 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 排出体外；进入呼吸道的铅 25%-30%被 吸收，粒径大于 10 m 的含铅颗粒主要 沉积于鼻腔和咽喉部，2.5m 以下者能 够到达肺泡。铅吸收后进入血液，约 96%迅 速与红细胞结合，只有 4%留在血浆中， 然后经血液循环分布到肝、肾、脾、肺 和脑等组织器官中4，其中以肝脏和肾 脏浓度最高5，最终蓄积到骨骼、牙齿 和毛发中，以磷酸铅的形式沉积下来6， 引发多种多系统性、多器官性的机体损 伤7。铅的吸收和分布示意图见图 1 所 示2。 1.2 氧化应激效应介绍 在正常的生理条件下，人体内存 在着氧化活性物质和抗氧化防御体系的 动态平衡，作用模式见图 2 所示。一旦 体内氧化活性物质含量增加或者体内抗 氧化防御体系被干扰和破坏，致使这种 动态平衡产生紊乱和失调，引起一系列 新陈代谢失常和免疫功能降低，形成氧 自由基连锁反应而导致各组织发生氧化 损伤，这就是氧化应激效应8。所说的 氧化物质主要包括活性氧物质 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 （Reactive Oxygen Species， ROS）和 活性氮物质（Reactive Nitrogen Species， RNS） ，其中 ROS 是主要的 氧化活性物质，主要包括过氧化氢 （H2O2） 、超氧阴离子（O2 -）和羟 基自由基（HO ）等9， 10。正常 条件下，人体内存在一定量的 ROS，作 为体内多种代谢和信号通路的信使，通 过激活和调控各种转录因子参与体内多 种基因的转录及相关功能蛋白的表达， 参与细胞的增殖、分化及迁移及促进和 维护细胞、组织和机体的新陈代谢 11， 12。但是 ROS 具有较强的反应 活性和氧化性，当 ROS 浓度较高时， 会直接或间接对 DNA、蛋白质及脂类 物质发生氧化损伤，造成细胞凋亡 （apoptosis） 、衰老（senescence）和死 亡（death）13-16。 大量体外和体内实验的研究表明， 辐射和外源化学物（包括重金属类物质） 是 ROS 介导的细胞损伤的主要环境诱 导因子。电离辐射会通过氧化 H2O 产 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 生 HO 17 ，皮肤受到紫外线（290- 400 nm）照射会产生大量 ROS，进而干 扰了调控细胞增殖和分化的主要信号通 路，影响了细胞的正常生理功能18。 外源化学物如乙醇和苯巴比妥类物质通 过改变细胞色素 P450 的途径，导致细 胞色素 P450 的 4A 过氧化物酶体增殖， 而导致了过氧化氢的产生19。重金属 类污染物被认为是外源化学物中毒性较 强的一类物质，它们发挥毒性效应的关 键因素就是诱发机体产生氧化应激20- 23。首先，重金属类物质可以参与类 Fenton 反应产生更多的 ROS，是诱发氧 化应激的直接因素24 ；其次，重金属 类物质易与体内抗氧化物质如还原型谷 胱甘肽（GSH）发生共价结合而使其丧 失消除 ROS 的能力25 ， 26；另外， 重金属类物质可以与抗氧化酶及谷胱甘 肽相关酶发生相互作用，影响酶的活性 和浓度，从而干扰体内的氧化还原反应 27-29。后面这两种情况是重金属产生 氧化损伤效应的非直接因素。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 同时，体内存在着抗氧化防御系 统，由抗氧化物质、抗氧化酶及非酶抗 氧化蛋白组成30 。抗氧化物质主要包 括 GSH、维生素 C、维生素 E、黄酮类 物质、尿酸等；抗氧化酶主要包括超氧 化物歧化酶（SOD） 、过氧化氢酶 （CAT） 、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX） 、 谷胱甘肽还原酶（GR） 、谷胱甘肽转硫 酶（GST）及溶菌酶（Lysozyme）等； 非酶抗氧化蛋白是指不直接参与分解代 谢 ROS 物质，却能起到维持体内氧化 还原平衡作用的蛋白，主要包括血红蛋 白、肌红蛋白等含有铁/亚铁离子的传输 蛋白、各种金属硫蛋白及人绒毛膜促性 腺激素（HCG）等可以抑制氧化应激过 程中细胞凋亡等损伤的功能蛋白31-33。 体内抗氧化防御体系的存在，催化清除 或分解代谢了过量产生的 ROS，保障了 各组织器官的正常生理功能。 1.3 铅引发的毒性效应与氧化应 激的关系 E. D. Willis 于 1965 年最先发现 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 铅毒性与氧化应激相关34。铅的致病 机理是较为复杂的，它可以与抗氧化酶 发生直接作用35-38 ，竞争性抑制重要 微量矿物质的吸收，还能与体内含巯基 物质发生共价结合使其失去抗氧化作用 22。铅诱发的氧化损伤作用主要通过 两种独立而又具有相关性的机理。首先， 铅可以直接诱导机体产生单线态氧、过 氧化氢及超氧化物等活性氧物质；第二 种机制为铅能够消耗细胞内的抗氧化物 质，其中铅影响 GSH 代谢途径是最主 要的机理39 。GSH 是由半胱甘酸 （Cys） 、谷氨酸（ Glu）和甘氨酸 （Gly）组成的三肽，在淋巴细胞间质 产生，是人体中最主要、含量最高的巯 基类抗氧化物质40 。GSH 除了可以清 除体内的活性氧之外，还可以与毒性重 金属发生结合，削弱其毒性效应41。 在铅暴露动物实验的研究中，血液、肝 脏和肾脏等器官中 GSH 的浓度明显低 于未暴露组42-44 。 铅能够直接与含有巯基的抗氧化 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 酶发生共价结合，使这些酶失活，从而 破坏了氧化还原平衡状态。Ahamed 等 人报道在印度勒克瑙市一个铅工业暴露 的地区，血铅水平为 11.39 g/dL 左右 的儿童，血液中羟基乙酰丙酸脱氢酶 （ALAD）和 GSH 的含量明显低于血铅 水平在 7.11 g/dL 左右的儿童 35。 ALAD 能够催化亚铁血红素（heme）的 生成，从而维持血红蛋白的携氧能力， 因此铅对 ALAD 活性的抑制作用是铅发 挥毒性很关键的一个方面45。Hunaiti 等发现在约旦伊尔比德市的从事铅行业 工人的血液中，GR、GPX 和 GST 的含 量均与血铅水平呈反比，表明铅暴露使 上述三种谷胱甘肽相关酶含量均发生下 降，从而干扰了 GSH 代谢途径46。 目前，铅的毒性效应与氧化应激 的相关性研究已有大量报道，因此本文 将从动物、细胞和分子三个水平上分别 综述铅暴露诱发氧化应激的研究进展， 并从中找到尚未搞清楚的科研问题，作 为后续工作的研究重点。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 2 动物、细胞和分子水平上铅暴 露诱发氧化应激的研究进展 2.1 动物水平上铅暴露诱发氧化 应激的研究进展 研究表明，长期铅暴露可导致肝 脏、肾脏、生殖系统及神经系统的病变。 对于铅毒性效应的研究大部分集中在流 行病学领域，通过研究人群血铅水平、 与身体各器官相关病变的生物学效应之 间的关系来评价铅的毒性，为提出有效 的治疗方案提供数据支持47-49。但是 流行病学研究并不能实现铅暴露剂量变 化与氧化应激相关生物学效应关系的研 究，因此不能揭示铅诱发氧化应激的毒 性作用机理。因此很多学者从动物水平 上研究了铅毒性与氧化应激的关系。 实验动物经铅暴露后，其抗氧化防御体 系的变化情况是动物水平研究中主要关 注的问题。Farmand 等人研究了雄性 Sprague-Dawley 鼠经不同剂量铅染毒后 主要抗氧化酶 Cu/Zn SOD、CAT 及 GPx 活性及含量的变化，结果显示铅暴 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 13 露导致鼠胸动脉中 Cu/Zn SOD 活性升 高，CAT 和 GPx 活性没有变化，而且 这三种酶的含量均未发生变化；在鼠肾 脏和髓质中 Cu/Zn SOD 和 CAT 活性升 高，而 GPx 活性没有变化。因此 Farmand 认为铅暴露后抗氧化酶活性升 高是实验动物在氧化应激状态下的一种 反馈抵抗机制50 。但是 Sivaprasad 课 题组的研究结果却与上述报道相反：他 们在铅暴露后的小鼠血液红细胞中发现 Cu/Zn SOD、CAT 和 GPx 活性下降， 因此解释为酶活性下降是铅诱发氧化应 激的标志51 。以上不同的实验结果表 明，在不同的暴露剂量、暴露时间和靶 器官等实验条件下，铅暴露过程中抗氧 化酶活性变化规律不具有确定性，而且 目前的研究并未阐明由于铅暴露导致酶 活性的变化，引起体内氧化还原状态的 失衡造成氧化损伤的发生；还是铅暴露 诱发机体氧化损伤，导致了酶活性变化 52。针对这一问题，我们研究了斑马 鱼水平上铅暴露诱发氧化应激过程中 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 14 SOD 活性变化的机理：铅暴露打破了斑 马鱼肝脏中的氧化还原稳态，导致 SOD 酶活性下降，谷胱甘肽相关酶 GPx、GR 和 GST 活性受到抑制， GSH/GSSG 比率下降，并对细胞膜结构 产生了氧化损伤，导致脂质过氧化物 MDA 含量增加；然后利用多种光谱学 方法、ITC 法及分子对接模拟等方法从 生物大分子层面上深入探讨了铅暴露诱 发斑马鱼氧化应激过程中 CAT 活性降 低的机理。研究发现铅通过静电作用 （H0）与酶催化关键氨基酸残基 Arg 141 发生了直接作用，使铅结合到 SOD 的活性通道内，阻碍了底物（O2-） 进入酶活性中心的路径，破坏了 SOD 的骨架结构和二级结构，并使活性中心 的 Cu2+和 Zn2+释放出来，从而导致了 SOD 活性的下降53。 当铅暴露导致机体各组织氧化损 伤程度较深时，产生的 ROS 会进攻膜 结构中的磷脂层，产生脂质过氧化反应 31。脂质过氧化程度取决于膜结构中 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 15 脂肪酸的饱和程度，不饱和程度越高 （不饱和键越多） ，越容易发生脂质过 氧化反应。脂质过氧化将使细胞膜的流 动性和通透性改变，导致细胞结构和功 能的异变，最终导致多器官损伤的发生 54。Gerber 和 Rehman 发现在铅暴露 的小鼠大脑匀浆液中脂质过氧化物的产 生量随着铅染毒浓度的升高而增多 55， 56。而且 Rehman 还研究了小鼠 大脑不同区域铅的含量，他发现铅富集 量大的区域，脂质过氧化程度高57。 Adanaylo 和 Oteiza 也证实铅暴露干扰 了小鼠大脑中抗氧化防御体系，作为脂 质过氧化的生物标志物 MDA 含量升高 58。刘芳丽等人在铅暴露后的小鼠肝 脏和肾脏中均发现了 MDA 含量的升高， 且加入抗氧化物质白藜芦醇后减轻了铅 的脂质过氧化水平59 。 2.2 细胞水平上研究铅诱发氧化 应激的研究进展 动物水平的研究结果分析了铅暴 露引发毒性效应与氧化应激的相关性， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 16 阐明了铅暴露导致组织器官损伤及引发 各种疾病的重要机理是铅破坏了体内氧 化还原状态，是机体发生氧化损伤所致。 但是动物水平上的铅毒性评价并不能解 释铅暴露诱发细胞毒性的微观机制，也 就无法研究细胞内发生氧化应激作用机 理。因此，很多研究者开始从细胞水平 上研究铅诱发氧化应激的机理及其与细 胞凋亡等细胞毒性的关系。 已有研究表明铅毒性引起细胞损 伤与细胞内氧化还原状态异常有关。 Yedjou 和 Tchounwou 研究发现铅引起 HepG2 细胞活力下降与细胞内 ROS 含 量升高有关，同时铅暴露引起细胞内 MDA 含量显著升高；当铅暴露同时加 入抗氧化物质 N-乙酰-L- 半胱氨酸 （NAC） ，会使细胞内 ROS 含量显著降 低，而且显著提高了细胞成活率。表明 NAC 抑制了铅暴露引发细胞产生的氧 化应激效应60 。Stacchiotti 等人选取小 鼠肾脏近曲小管细胞（NRK-52E）为靶 细胞进行铅暴露后，引起了细胞凋亡和 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 17 坏死、线粒体损伤等细胞损伤作用，而 且伴随着细胞内 ROS 和 RNS 含量的升 高61。Navarro-Moreno 等人同样在小 鼠肾脏近曲小管细胞中发现了细胞损伤 与氧化影响的相关性62 ，评价了铅对 PC 12 细胞的细胞毒性。Jadhav 等发现 低浓度铅急性暴露（0.01 M，24 h）可 激活细胞内蛋白激酶 C（PKC ）的活性， PKC 的活化调节了钙传输相关的 NMDA 受体通道，从而提高了细胞内 Ca2+含量；而 NMDA 受体激活将促进 兴奋型氨基酸谷氨酸盐的释放，进而引 发细胞内 ROS 含量上升，产生氧化应 激效应。他们进一步研究了铅与谷氨酸 盐对 PC12 细胞的联合暴露效应，发现 细胞内 ROS 含量大幅升高，细胞成活 率显著降低，表明铅能够通过调节 PCK 活性进而引发细胞产生氧化损伤63。 在铅暴露诱发细胞氧化损伤的过 程中，细胞内有着“ 动力车间 ”之称的线 粒体起着至关重要的调节作用。线粒体 的功能与 ROS 的产生及代谢密切相关， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 18 一方面线粒体在氧化代谢制造 ATP 过 程中会伴随大量 ROS 的产生，在正常 生理条件下其生成速率与线粒体膜电位 水平（MMP ）有直接关系 64。Suski 等人证实线粒体膜电位降低直接导致 ROS 的产生量增大65；另一方面线粒 体内的抗氧化防御体系能够有效消除过 量的 ROS，使自身免受氧化损伤而继续 发挥其重要生理功能66 。当细胞内氧 化应激程度较严重时，过量蓄积的 ROS 可氧化渗透性转运通道上的敏感位点， 会导致线粒体发生形态肿胀、膜电位降 低等氧化损伤效应，产生严重的细胞毒 性67。同时，线粒体在细胞凋亡过程 中发挥重要作用。Oluwole 等人于 1998 年在 science 杂质上详细分析了线粒体 参与细胞凋亡的相关机理：（1）线粒 体功能的紊乱导致细胞凋亡的产生，包 括电子传递、氧化磷酸化和 ATP 产量 的紊乱；（2）线粒体通过释放细胞色 素 C 等信号因子激活 Caspase 家族，从 而导致细胞凋亡的产生；（3）线粒体 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 19 内氧化还原电位的改变，导致 MMP 值 变化及调控 Bcl-2 家族的磷酸化水平， 从而达到调控细胞凋亡的目的68。王 林等人研究了铅暴露对大鼠肾小管上皮 细胞 MMP 值与 ROS 含量的关系，发现 铅染毒使肾细胞内 ROS 大量产生，且 伴随着 MMP 数值下降。这是由于蓄积 的 ROS 会直接靶性损伤线粒体膜结构， 引起 MMP 值下降，进而导致了细胞凋 亡69。徐进等人研究发现铅暴露可导 致 PC 12 细胞 DNA 损伤及细胞凋亡， 同时伴随着凋亡信号通路 Bax 表达量上 升、Bcl-2 表达量下降、P53 表达量增加 且 Caspase-3 被激活。表明铅诱发 DNA 损伤与 P53 表达量上调有关，导致 Bax/Bcl-2 状态失衡和线粒体损伤，从 而激活了 Caspase-3，进一步引起了细 胞凋亡70。 2.3 分子水平上研 究铅诱发氧化应激的研究进展 研究表明，重金属引发生物体毒 性效应是从生物大分子开始的，比如各 种酶、非酶功能性蛋白、DNA 和 RNA -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 20 等，然后逐步在细胞层面、组织器官层 面和个体层面反映出来71，因此研究 重金属与生物大分子的相互作用，能从 分子层面上解释重金属引发毒性效应的 机理，为与重金属相关疾病的早期诊断 及治疗提供依据。但目前从分子层面上 研究铅与生物大分子的相互作用研究很 少。Belatik 等人利用 FTIR、紫外可见 吸收光谱、圆二色谱、荧光光谱仪和 X 射线光电子能谱等技术从分子水平上对 比研究了铅（II）与 HSA 与 BSA 的结 合模式。Vega 等人通过研究铅与人鱼 精蛋白（HP2）的直接作用来解释铅的 生殖毒性。他们通过多种光谱学手段研 究了铅对 HP2 结构的影响，结果显示铅 结合到 HP2 的两个结合位点处，从而破 坏了 HP2 的生理结构，并认为由于 HP2 对铅和锌的亲和力类似，因此铅暴 露会竞争性抑制锌与 HP2 的结合从而引 发生殖毒性效应。 但分子水平的研究中存在一些方 法学问题。首先上述研究中都未考虑荧 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 21 光内滤效应对体系荧光变化的影响。荧 光内滤效应是指溶液在激发波长和发射 波长处的光发生吸收或色散而导致荧光 信号减弱的现象。针对这一问题，我们 课题组已经提出利用内滤校正公式和外 滤校正装置来消除内滤效应影响的方法 72， 73，但是内滤校正公式的适用性 有待进一步研究。因此最好的校正内滤 的方法应该是避免内滤效应的产生74。 一般认为，让溶液在激发波长到扫描的 发射波长范围内的吸光度小于 0.1 时， 可以忽略内滤效应的影响。由于没有校 正内滤效应，利用 Stern-Volmer 方程判 别荧光猝灭机理的类型就存在问题。事 实上，最准确的荧光猝灭类型判别方法 是考察反应体系荧光寿命的变化75。 另一个问题是利用双对数 Stern-Volmer 方程 计算结合位点数和结合常数，并 进一步通过热力学常数的计算确定结合 作用力类型。但这个方程当且仅当配体 与受体的结合属于无限协同反应 （infinite cooperativity） ，受体的结合位 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 22 点全空或者全满）时才能用来计算结合 常数及结合位点数75 。近几年等温滴 定微量热技术（ITC）的发展为研究配 体与受体相互作用过程的结合常数、结 合位点数及作用力类型成为可能76， 77。针对上述问题，我们利