《生物技术制药》复习资料

生物技术制药复习资料 （Biotechnological Pharmaceutics） 第一章 绪论 一、概述 1.概念：生物药物（生物制药）是泛指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物 或生物体的某一组成部分，甚至整个生物体用作诊断和治疗疾病的医药品。|采用现代生物 技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品，叫做生物 技术制药。 2.技术范畴：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程以及后来衍生出来的第 二代、第三代的蛋白质工程、抗体工程、糖链工程和海洋生物技术等。 3.相关学科：有生物学（含微生物学、分子生物学、遗传学等） 、化学、工程学（化学工程、 电子工程等） 、医学、药学、农学等。但从基础学科来讲，生物学、化学和工程学是其主要 的学科。 4.应用范围：（1）医药；（2）农业；（3）食品；（4）工业；（5）环境净化；（6）能 源。 二、生物技术的发展简史 1.传统生物技术阶段 主要产品：乳酸、酒精、丙酮、丁酸、柠檬酸、淀粉酶。 生产的特点：过程简单，大多属兼气发酵或表面培养，生产设备要求不高，产品化学结构 简单，属初级代谢产物。 2.近代生物技术阶段 主要产品：抗生素、维生素、甾体、氨基酸；食品工业的工业酶制剂、食用氨基酸、酵母、 啤酒；化工业的酒精、丙酮、丁醇、沼气；农林业的农药；环境保护业的生物治理污染。 生物技术的特点：（1）产品类型多，初级（氨基酸、酶、有机酸） 、次级（抗生素） 、生物 转化（甾体） ；（2）生物技术要求高，纯种、无菌、通气，产品质量要求也高；（3）生产 设备规模大；（4）技术发展速度快。 3.现代生物技术 主要产品：胰岛素、干扰素、生长激素等。 生物技术的内容包括：（1）重组 DNA 技术及其它转基因技术（基因工程） ；（2）细胞和原 生质体融合技术（细胞工程） ；（3）酶或细胞的固定化技术（酶工程） ；（4）植物脱毒和 快速繁殖技术；（5）动物细胞大量培养技术；（6）动物胚胎工程技术；（7）现代发酵技 术；（8）现代生物反应工程和分离工程技术；（9）蛋白质工程技术；（10）海洋生物技 术。 三、医药生物技术的新进展 1.基础研究不断深入 2.新产品不断出现 3.新试剂、新技术不断出现 4.新型生物反应器和新分离技术不断出现 四、我国的医药生物技术 五、医药生物技术的新进展 1.利用新发现的人类基因，开发新型药剂。 2.新型疫苗的研制。 3.基因工程活性肽。 4.其他。如疾病早期诊断，PCR，单克隆抗体。 第二章 生物药物概论 第一节 生物药物的来源、特性、分类与制备 一、生物药物的来源 1.生物药物是指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、 体液等，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术和药学等学科的原理和方法制造的 一类用于预防、治疗和诊断的制品。 2.生物药物的原料来源 天然的生物材料：人体、动植物、微生物和各种海洋生物。 人工制得的生物原料如基因工程技术制得的微生物或细胞。 二、生物药物的特性 1.药理学特性（优点） （1）治疗的针对性强。细胞色素 C 用于治疗组织缺氧所引起的一系列疾病；（2）药理活 性高。注射用的纯 ATP 可以直接供给机体能量；（3）毒副作用小，营养价值高。蛋白质、 核酸、糖类、脂类等生物药物本身就直接取自体内；（4）生理副作用常有发生。生物体之 间的种属差异及个体差异，用药时会发生免疫反应和过敏反应。 2.生产、设备中的特殊性 （1）原料中的有效物含量低。激素、酶在体内含量极低；（2）稳定性差。生物药物的分 子结构中具有特定的活性部位，该部位有严格的空间结构，一旦结构破坏，生物活性也就 随着消失；（3）易腐败。生物药物营养价值高，易染菌、腐败。生产过程中应低温、无菌； （4）注射用药有特殊要求。均一性、安全性、稳定性、有效性。 3.检验上的特殊性 由于生物药物具有生理功能，故生物药物不仅要有理化检验指标，更要有生理活性检验指 标。 三、生物药物的分类 1.（生物制药的研究内容）按生物工程学科范围分为四类分类： （1）发酵工程制药；（2）基因工程制药：（3）细胞工程制药；（4）酶工程制药。 2.按药物的结构分类： （1）氨基酸及其衍生物类药物；（2）多肽和蛋白质类药物；（3）酶和辅酶类药物； （4）核酸及其降解物和衍生物类药物；（5）糖类药物；（6）脂类药物；（7）细胞生长 因子；（8）生物制品类。 3.按来源分类： （1）人体组织来源。疗效好、无副作用、来源有限。 （2）动物组织来源。动物脏器，来源 丰富、价格低廉、可以批量生产。 （3）植物组织来源。中草药，酶、蛋白质、核酸。 （4） 微生物来源。抗生素、氨基酸、维生素、酶。 （5）海洋生物来源。动植物、微生物。 4.按生理功能和用途分类： （1）治疗药物。肿瘤、艾滋病、心脑血管疾病等。 （2）预防药物。传染性强的疾病，疫苗、 菌苗、类毒素。 （3）诊断药物。速度快、灵敏度高、特异性强。免疫诊断、酶诊断、基因 诊断试剂。 （4）其它。生化试剂、保健品、化妆品、食品、医用材料。 四、生物药物的制备过程 1.生物药物原料的选择、预处理与保存方法 （1）原料选择原则 3 有效成分含量高，原料新鲜，来源丰富、易得，产地较近，原料中杂质含量少，成本低。 （原料 粗提 精提） 生物技术 单元操作 （2）预处理与保存 预处理：就地采集后去除结缔组织、脂肪组织等不用的成分，将有用成分保鲜处理，收集 微生物原料时，要及时将菌体与培养液分开，进行保鲜处理。 保存方法：冷冻法，适用于所有生物材料，-40；有机溶剂脱水法，丙酮，适用于原 料少、价值高，有机溶剂对原料生物活性无影响；防腐剂保鲜，常用乙醇、苯酚等，适 用于液体原料，如发酵液、提取液。 第二节 人体来源的药物 一、人体来源药物的特点与研究意义 1.人体来源的药物的特点 （1）安全性好。不易产生副反应。 （2）效价高、疗效可靠。质量好、效价高。 （3）稳定性 好。冻干制剂 10 度以下可保存 2 年以上。 3.研究意义 （1）资源的有限性；（2）意义。 3.蛋白质类药物分离提取方法 （1）沉淀法（盐析、有机溶剂、等电点） ；（2）按分子大小分离（超滤、透析、层析、离 心） ；（3）电荷（离子交换、层析、电泳、等电聚焦） ；（4）亲和层析法（酶与底物、抗 原与抗体） 。 二、人体来源药物的种类和用途 1.人血液成分制品 （1）红细胞制剂；（2）白细胞浓缩液；（3）血小板制剂；（4）新鲜冰冻血浆（FFP） 。 2.血浆的综合利用 （1）传输蛋白质；（2）免疫球蛋白；（3）凝血系统蛋白；（4）补体系统蛋白；（5）蛋 白酶抑制物类。 3.人体液细胞中的活性物质 体液细胞包括红细胞、白细胞、淋巴细胞、血小板、成纤维细胞等。活性物质主要是干扰 素 、白介素-2、超氧化物歧化酶等。 4.人类来源的其他原料的利用 5.细胞因子 6.人体激素 激素是调节机体正常发育和活动的重要物质，是由一类动物体内腺体细胞和非腺体组织细 胞所分泌的化学信息分子。激素主要有：蛋白质激素、多肽激素、氨基酸衍生物激素、脂 类激素。激素在体内含量很低，研究目的不是用生物体来提取，而是用于指导用其他原料 进行生产和如何正确使用激素药物进行治疗。现在的生产方法有：用动物提取，半合成法， 基因工程法。 第三节 动物来源的药物 三、动物来源药物的种类与用途 1.动物多肽与蛋白质类药物 （1）动物多肽药物的重要性与种类 重要性：脑垂体所分泌的多肽激素，药效显著，且毒副作用小，通过对这些活性物质的结 构和功能的研究，有助于我们设计和研制新型药物。 （2）动物蛋白类药物 2.动物酶与辅酶类药物 种类：促消化酶类（胃酶可口服，蛋白酶，胰酶） ；消炎酶类（溶菌酶、胰蛋白酶、糜蛋白 酶等可提高毛细血管通透性，消退浮肿） ；治疗心血管疾病（纤溶酶、尿激酶、凝血酶） ； 抗肿瘤的酶（天冬氨酰酶、谷氨酰胺酶、半胱氨酸酶、组氨酸酶） 。 3.动物核酸类药物 4.动物糖类药物 5.动物脂类药物：脂肪酸及其衍生物、磷脂类、胆酸类、卟啉和衍生物。 第四节 植物来源的药物 一、糖类单糖、多糖、寡糖。 二、脂类、类脂、固醇及其衍生物 三、蛋白质、多肽及其活性物质 四、化合物特别小分子化合物及其衍生物。是近几年来研究最为活跃的领域。 实例：超氧化物歧化酶的制备、精油、南瓜多糖等。 第五节 海洋生物药物 一、取得重要进展的领域 （1）海洋生物抗癌活性物质；（2）海洋生物抗菌活性物质；（3）海洋生物抗心血管疾病 活性物质；（4）海洋生物抗放射性活性物质及酶类；（5）海洋前列腺素；（6）海洋保健 品、螺旋藻；（7）海洋医用生物材料。鲎试剂、河豚毒素试剂、甲壳素、珊瑚。 二、我国发展海洋药物的主攻方向 1.海洋生物活性物质的研究 2.大力促进海洋生物技术在开发海洋药物上的应用 3.开发新的海洋中成药和新剂型 4.充分利用海洋资源，开发海洋保健品 5.开发新的海洋医用生物材料 第三章 生物技术制药单元操作与药物生产的质量控制 第一节 生物技术制药单元操作 一、概述 生物药物的提取和纯化可分为 5 个主要步骤：预处理、固液分离、浓缩、纯化和产品定型 （干燥，制丸，挤压，造粒，制片） ，每一步骤都可采用各种单元操作。 在提取纯化过程中，要尽可能减少操作步骤，因为每一操作步骤都不可避免带来损失。操 作步骤多，总收率就会下降。 二、提取纯化的工艺论证 工艺验证，就是通过系统的方法得到关于生产工艺的书面材料，证明并保证生产过程能始 终如一地生产出特定的高质量的产品。 工艺验证的范围：厂房设施、工程仪表、机械设施、生产环境、工艺条件、计算机软件、 介质、原材料、半成品、成品、操作人员素质和测试方法等。以上各个部分都要有验证材 料或试验数据，根据这些材料和数据写出验证报告。 当工艺的某一部分有较大变动时（如大修、工艺条件变化） ，要进行重新验证，即再验证。 再验证是针对某一部分的行动，而不是整个工艺过程的验证，因而比较简单、快速、易行。 验证的实施过程包括以下步骤：提出验证要求，组织验证小组，制定验证方案，实施验证 试验，写出验证报告，再验证等。 三、原料选择、预处理与固液分离技术 5 （一）原料选择的基本准则 1.在大量的信息资料和实践经验的基础上，选择目标原料； 2.选择有效成分含量高的新鲜材料； 3.来源丰富易得； 4.制造工艺简单易行； 5.成本比较低； 6.原料的采集不破坏生态环境，选择对环境友好的原材料资源，防止生物入侵。 （二）细胞破碎 机械法：珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法、X-press 法等。 非机械法：酶溶法、化学渗透法、冻融法、干燥法等。 （三）离心 1.差速离心法 2.速率区带离心法 速率区带离心法是在离心前于离心管内先装入密度梯度介质（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl 等） ，待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。 （四）膜分离法 1.薄膜分离 （1）超滤：根据溶质分子和悬浮粒子是否通过多孔膜来进行筛分。 （2）反渗透：以高分子透过性薄膜为分离介质，在超过溶液渗透压力的情况下，使溶液中 的溶剂透过薄膜，同时使溶质和不溶物阻截在膜前。 （3）微孔滤膜：由高分子材料制成的薄膜过滤介质，可以过滤一般介质不能截留的细菌和 微粒。膜的孔径在 0.210m。 （4）渗析：它是利用多孔膜两侧溶液的浓度差使溶质从浓度高的一侧通过膜孔扩散到浓度 低的一侧从而得到分离的过程。 （5）电渗析：电渗析是基于离子交换膜能选择性的使阴离子或阳离子通过的性质，在直流 电场的作用下使阴阳离子分别透过相应的膜以达到从溶液中分离电解质的目的。 2.膜分离设备 （1）板框式膜组件；（2）卷式膜组件；（3）管式膜组件；（4）中空纤维膜组件。 四、沉淀法 1.盐析法 利用不同的蛋白质在高浓度盐溶液中，溶解度不同程度的降低来进行分离纯化。在低盐浓 度下，溶解度随着盐浓度升高而增加，称盐溶作用；当盐浓度不断升高时，不同蛋白质的 溶解度又以不同程度下降并先后析出沉淀，称盐析作用。 优点：设备和条件要求低，安全应用范围广泛。在高盐情况下，蛋白质不易发生变化，一 般在室温下操作。 缺点：分级分离能力不高。 盐析时应注意的几个问题： （1）盐饱和度：由于蛋白质的结构和性质不同，盐析要求的饱和度也不同。要按工艺要求， 正确计算饱和度。 （2）pH 值的选择：蛋白质在 pI 时的溶解度最小。因此，进行盐析时的 pH，要选择在被分 离蛋白质的 pI 附近。 （3）蛋白质浓度（蛋白质的溶解度）：在相同条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，使用盐 的饱和度极限也愈低。蛋白质浓度愈高，其他蛋白质共沉作用也愈强，这是不希望的。选 择适当的蛋白质浓度，可避免共沉的干扰。 （4）温度：一般在室温下进行，浓盐对蛋白质有保护作用。但对温度敏感的，要在低温下 进行。常在 0-4范围内迅速操作。如尿激酶。 （5）盐析沉淀物的脱盐：盐析的沉淀分离后，经脱盐才能获得纯品。最常用的脱盐方法是 透析，时间一般较长，应常换透析液，注意防止污染。 2.有机溶剂沉淀法 利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离目的蛋白质的方法。蛋白质 的沉淀与溶解，与溶剂的介电常数有关。降低溶液的介电常数，使其溶解度变小，同时， 还破坏蛋白质的水化膜而使蛋白质沉淀析出。 有机沉淀法应注意的问题： （1）控制工艺过程的温度：整个操作规程应在低温下进行，而且最好是同一温度。 （2）防止溶剂局部温度过高：加入有机溶剂时搅拌要均匀，速度要适当，避免局部浓度过 高，引起沉淀物的破坏、变性或失活。 （3）及时处理沉淀物：沉淀物经过滤或离心后，要立即用水或缓冲液溶解，降低有机溶剂 的浓度。 （4）pH 的选择：在待沉淀蛋白质的 pI 附近（，蛋白质在 pI 时的溶解度最小） 。 （5）有机溶剂是酶和蛋白质的变性因素，尤其是对敏感酶类。 3.等电点沉淀法 利用蛋白质在等电点时的溶解度最低，而各种蛋白质又具有不同的等电点的特性进行分离 的工艺过程。 4.水溶性非离子型聚合物沉淀法 在一定的 pH 值下，盐浓度越高，所需 PEG 时浓度越低，溶液的 pH 越接近目的物的等电点， 沉淀所需 PEG 的浓度越低。 五、萃取 （一）双水相萃取 双水相体系的形成是两种天然或合成的亲水性聚合物水溶液相互混合，由于较强的斥力或 空间位阻，相互之间无法渗透，在一定条件下，即可形成双水相体系。 双水相萃取的技术特征： （1）体系有生物亲和性。 （2）体系能进行萃取性的生物转化。 （3）体系能与细胞相结合， 操作既节省萃取设备和时间，又避免了胞内酶的损失。 （4）亲和萃取可大大提高分配系数 和萃取专一性。 （5）任何两相体系，都不要求特殊的处理就可与后续纯化工艺相衔接。 （6）开发廉价新型的双水相体系。 （二）超临界流体萃取 1.技术原理 在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点 高低和分子量大小的成分依次萃取出来。 2.萃取装置 超临界萃取装置从功能上大体可分为八部分：萃取剂供应系统、低温系统、高压系统、萃 取系统、分离系统、改性剂供应系统、循环系统和计算机控制系统。 3.超临界流体萃取（SFE）的特点（优点） （1）可以在接近室温（35-40）及 CO2气体笼罩下进行提取，有效地防止了热敏性物质 的氧化和逸散。 （2）使用 SFE 是最干净的提取方法，由于全过程不用有机溶剂，因此萃取物绝无残留溶媒， 同时也防止了提取过程对人体的毒害和对环境的污染，是 100%的纯天然（产物中无杂质） ； 7 （3）萃取和分离合二为一，当包含溶解物的 CO2-SCF 流经分离器时，由于压力下降使得 CO2与萃取物迅速成为两相（气液分离）而立即分开，不仅萃取效率高而且能耗较少，节约 成本（SCF 立方英尺） ； （4）CO 2是一种不活泼的气体，萃取过程不发生化学反应，且属于不燃性气体，无味、无 臭、无毒，故安全性好； （5）CO 2价格便宜，纯度高，容易取得，且在生产过程中（可）循环使用，从而降低成本； （6）压力和温度都可以成为调节萃取过程的参数。通过改变温度或压力达到萃取目的。 六、层析法 1.离子交换层析。2.凝胶层析。3.亲和层析。 七、电泳技术 （一）醋酸纤维素薄膜电泳。 （二）琼脂糖凝胶电泳。 （三）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 。 （四）等电聚焦电泳技术。 八、其它技术 （一）浓缩是指低浓度溶液通过除去溶剂变为高浓度溶液的过程。常在提取后和结晶前进 行，有时也贯穿于整个制药过程。 （二）结晶是利用某些药物具有形成晶体的性质是目标药物（溶质）呈晶态从溶液中析出 的过程。 （三）干燥是从湿的固体生物药物中，除去水分或溶剂而获得相对或绝对干燥制品的工艺 过程。它也是一种蒸发，但不同于浓缩。通常包括原料药的干燥和制成临床制剂的干燥。 （1）常压干燥。通风与加热结合。成本低，干燥量大。但时间长，易污染。 （2）减压干燥。利用专用设备减压加速，使溶剂迅速蒸发。时间短，温度低。制药常用方 法。 （3）喷雾干燥。将液体通过喷射装置喷成雾滴后，在一定流速的热气流中，迅速蒸发干燥 的方法。 第二节 生物技术药物生产的质量控制 什么是药品的六个“P”？ 1.什么是 GAP？ GAP：英文名称“Good Agricultural Practice”的缩写。直译为“良好的农业规范（因为 中药材栽培或饲养主要属于农业范畴） ”，在中药行业译为“中药材生产质量管理规范” 。 2.什么是 GCP？ GCP：英文名称“Good Clinical Practice”的缩写。中文名称为“药品临床试验管理规范” ， 是规范药品临床试验全过程的标准规定，其目的在于保证临床试验过程的规范，结果科 学可靠，保护受试者的权益并保障其安全。 3.什么是 GLP？ GLP：英文名称“Good Laboratory Practice”的缩写。中文名称为“药品实验室管理规范” 。目前，在我国是指于 2003 年 9 月 1 日起施行药物非临床研究质量管理规范 （局令第 2 号） 。 4.什么是 GSP？ GSP：英文名称“Good Supply Practice”的缩写。中文名称为“药品经营质量管理规范” ， 它 是控制医药商品流通环节所有可能发生质量事故的因素从而防止质量事故发生的一整套 管理程序。 5.什么是 GUP？ GUP：英文名称“Good Use Practice”的缩写。中文名称为“药品使用质量管理规范” ，在 我国是指 医疗机构药剂质量管理规范 。 6.什么是 GMP？ GMP：英文名称“Good Manufacturing Practice”的缩写。中文名称为“药品生产质量管 理规范” ，在我国，GMP 是指 国家药品监督管理局于 1999 年 3 月 18 日通过，6 月 18 日发 布，8 月 1 日起开始正式实施的药品生产质量管理规范 （局令 9 号） 。这个规范是药品 生产和质量管理的基本准则，适用于药品制剂生产的全过程和原料生产中影响成品质量的 关键工序。它是一种强制性认证，没有通过认证的生产企业或生产车间已于 2004 年 7 月 1 日实行强制性停产。 第四章 基因工程制药 第一节 概述 问题：基因工程菌生产药物的优点？ 第二节 基因工程药物生产的基本过程 主要程序是：目的基因的克隆，构建 DNA 重组体，将 DNA 重组体转入宿主菌构建工程菌， 工程菌的发酵，外源基因表达产物的分离纯化，产品的检验等。 基因工程药物的生产是一项十分复杂的系统工程，可分为上游和下游两个阶段。上游阶段 是研究开发必不可少的基础，它主要是分离目的基因、构建工程菌（细胞） 。下游阶段是从 工程菌（细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。 第三节 基因工程药物的分离纯化 基因工程药物具有下列特点：（1）目的产物在初始物料中含量较低；（2）含目的产物的 初始物料组成复杂；（3）目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对 pH、温度、金属 离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易失活、变性；（4）种类繁多，包括 有大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂及性质各异的生物活性 物质；（5）应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热原等。 一、建立分离纯化工艺的依据 1.含目的产物的起始物料的特点： （1）菌种类型及其代谢特征。 （2）原材料和培养基的来源及其质量。 （3）生产工艺和条件。 包括灭菌方法和条件、生产方式、生产周期、生产能力、工艺控制条件、因素及方式等。 （4）初始物料的物理、化学和生物学特性。 2.物料中杂质的种类和性质 3.目的产物特性 4.产品质量的要求 二、分离纯化的基本过程 基因工程药物分离纯化一般不应超过 4-5 个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步 纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。 三、分离纯化的技术 1.细胞破碎与固液分离。2.目的产物的分离纯化。3.非蛋白质类杂质的去除。 分离纯化技术应满足下列要求：（1）技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性； （2）选择性要好，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数； （3）收率要高；（4）两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整，这样 可以减少工艺步骤；（5）整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。 四、选择分离纯化方法的依据 1.根据产物表达形式来选择 9 2.根据分离单元之间的衔接来选择 通常先运用非特异、低分辨的操作单元，以尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主 要的杂质；随后采用高分辨率的操作单元：凝胶排阻色谱这类分离规模小、分离速度慢的 操作单元放在最后。 3.根据分离纯化工艺的要求来选择 分离纯化工艺应遵循以下原则： （1）具有良好的稳定性和重复性（能产业化） 。 （2）尽可能减少组成工艺的步骤。 （3）组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，工艺与设备也能相互适应，从而 减少步骤之间对物料的处理和条件调整。 （4）在工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤，或干扰产品质量。 （5）分离纯化工艺所用的时间要尽可能短，因稳定性差的产物随工艺时间增加收率。 （6）工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备条件要求低，能耗低。 （7）具有较高的安全性。在选择后处理技术、工艺和操作条件时，要能确保去除有危险的 杂质，保证产品质量和使用安全，以及生产过程的安全。 第四节 基因工程药物的质量控制 一、原材料的质量控制 二、培养过程的质量控制 三、纯化工艺过程的质量控制（产品有足够的生理和生物学试验数据资料，确证提纯物分 子批间保持一致性。外源蛋白质，DNA 与热原质都控制在规定限度以下） 四、目标产品的质量控制 质量控制主要要求：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。 1.产品的鉴别。2.纯度分析。3.生物活性测定。4.稳定性考察。5.产品一致性的保证。 （6. 安全性） 五、产品的保存 1.液态保存 （1）低温保存；（2）在稳定 pH 条件下保存；（3）高浓度保存；（4）加保护剂保存。 2.固态保存 固态蛋白质比液态稳定，一般蛋白质含水量超过 10%时容易失活。含水量降到 5%时，在室 温或冰箱中保存比较稳定。冻干粉或结晶都具有强抗热性和稳定性。 第五章 细胞工程制药 第一节 概述 细胞工程可分为动物细胞工程和植物细胞工程。 动物细胞工程包括：细胞培养技术；细胞融合技术；胚胎工程技术；克隆技术。 植物细胞工程包括：植物组织、器官培养技术；细胞培养技术；原生质体融合与培养技术； 亚细胞水平的操作技术等。 第二节 动物细胞工程制药 1.细胞融合。单克隆抗体。 2.核移植就是将一个动物的细胞核，移植到卵细胞中，并发育成长。 3.转基因动物是指经人的有意干涉，通过实验手段将外源基因导入动物细胞中并稳定地整 合到动物基因组中，且能遗传给子代的动物。 4.动物细胞培养。是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖的过程。 第三节 植物细胞工程制药 1.组织及细胞培养。2.遗传特性改造。3.转基因植物。 转基因植物生产重组蛋白具有以下优点：1.与动物细胞培养相比，植物细胞培养条件简单 且易于成活，有利于遗传操作；2.植物培养细胞具有全能性，能够再生植株；3.转基因植 物中的外源基因可通过植物杂交的方法进行基因重组，进而在植物体内积累多基因；4.转 化植株系的种子易于贮存，有利于重组蛋白的生产和运输；5.用动物细胞生产重组蛋白， 可能污染动物病毒，这对人类可能造成潜在危险，而植物病毒不感染人类，所以用植物细 胞生产重组蛋白更为安全；6.植物细胞有与动物细胞相似的结构和功能，有利于重组蛋白 的正确装配和表达。 第四节 细胞工程制药未来发展前景 1.人源化抗体的研制和生产 注入人体后会产生抗体（抗抗体）或激发免疫反应。 2.启动“分子药田”工程 3.实施“动物药厂”计划 第六章 酶工程制药 第一节 概述 酶工程（Enzyme Engineering）是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技 术学科。 酶工程的主要内容：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定 化酶的应用。 现代酶工程的主要（研究）内容： （1）酶的分离纯化（提纯） 、大批量生产及新酶和酶的应用开发； （2）酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、反应检测等； （3）酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶（突变酶）的研究； （4）酶的分子改造和化学修饰， （以及酶的）结构与功能（之间关系）的研究； （5）有机相中酶反应的研究； （6）酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究； （7）抗体酶、核酸酶的研究； （8）模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。 第二节 药用酶的生产 （药用酶：可用于预防和治疗疾病的酶。 ） 一、药用酶的生产方法 （1）提取法；（2）生物合成法；（3）化学合成法。 二、提高药用酶产量的措施 1.添加诱导物。2.控制阻遏物浓度。3.添加表面活性剂。4.添加刺激剂。5.添加产酶促进 剂。 第三节 药物的酶法生产 一、酶的选择与反应条件的优化 二、酶的固定化 制备固定化酶的过程称为酶的固定化，固定化所采用的酶，可以是经提取分离后得到的有 一定纯度的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上酶或酶系。 酶的一些不足： （1）酶的稳定性较差，在温度、pH 值和无机离子等外界因素的影响下，容易变性失活； （2）酶一般都是在水溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起， 反应结束后，即使酶仍有较高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅 11 使得成本较高，而且难于连续化生产； （3）酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给进一步的分离纯化带来一定的困难。 1.固定化酶的定义 固定化酶，是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理， 使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。 （酶类可粗分为天然酶和修饰酶，固定化酶属于修饰酶。 ） 2.固定化酶的特点（优点） （1）可以（在较长时间内）多次使用，而且在多数情况下，酶的稳定性提高。 （2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化，产品质量高。 （3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制。 （4）酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少。 （5）比水溶性酶更适合于多酶反应。 3.酶和细胞的固定化方法 酶和细胞的固定化方法的分类 （1）载体结合法 物理吸附法 物理吸附法是用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的一种固定化方法。 离子结合法 离子结合法是酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上的固定化方法 共价结合法 共价结合法是酶以共价键结合于载体上的固定化方法 （2）交联法（共价键） 交联法是用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之间交联的固定化方法。 （3）包埋法 网格型。将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型。 微囊型。将酶或细胞包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。 （4）选择性热变性法 4.酶和细胞的固定化过程中使用载体的条件： （1）固定化过程中不引起菌变性； （2）对酸碱有一定的耐受性； （3）有一定的机械强度； （4）有一定的亲水性及良好的稳定性； （5）有一定的疏松网状结构，颗粒均匀； （6）共价结合时具有可活化基团； （7）有耐受酶和微生物细胞的能力； （8）廉价易得。 （酶和细胞的固定化载体，主要有以下三类：） （1）吸附载体。吸附法有物理吸附和离子吸附两种。物理吸附所用的载体有无机物和有机 物。 （2）包埋载体。包埋法制备固定化酶或细胞的载体有卡拉胶等。目前，工业上应用的包埋 载体主要为卡拉胶、海藻胶等。 （3）共价结合载体（交联载体） 。用共价结合法制备固定化酶或细胞所用的载体有纤维素、 SephadexA200、琼脂、琼脂糖、苯胺多孔玻璃等。 5.固定化酶的制备技术 （1）物理吸附法中蛋白质与载体结合力较弱，而且酶容易从载体上脱落，活力下降，故此 法不常用；离子交换吸附法是将解离状态的酶溶液与离子交换剂混合后，洗去未吸附的酶 和杂质即得固定化酶，本方法中离子交换刘的结合蛋白质能力较强，常彼采用。 影响载体吸附的因素较多，如溶液的 pH、离子强度、温度、蛋白质浓度及载体的比表面积 等。 （2）包埋法制备固定化酶技术 包埋法又分为凝胶包埋法和微囊化包埋法两类。凝胶包埋这是将酶或细胞限制于高聚物网 格中的技术；微囊化法是将酶或细胞定位于不同构型的膜外壳内的技术。 其基本制备方法有界面沉降法及界面聚合法两类。 界面沉降法。本法是物理法，是利用某些在水相和有机相界面上溶解度极低的高聚物成 膜的过程将酶包埋的方法。其基本过程是将酶液在与水不混溶的、沸点比水低的合机相中 乳化，使用油溶性表面活性剂形成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的高聚物加入搅拌下 的乳化液中，然后再加入另一种不能溶解高聚物的有机溶剂，使高聚物在油水界面上沉淀、 析出及成膜。最后在乳化剂作用下使微囊从有机相中转移至水相，即成为固定化酶。用于 制备微囊的高聚物材料有硝酸纤维素、聚苯乙烯及聚甲基丙烯酸甲酯等。微囊化的条件温 和，制备过程不致引起酶的变性，但要完全除去半透膜上残留的有机溶剂却不容易。 界面聚合法。本法是化学制备法，其基本原理是利用不溶于水的高聚物单体在油水界 面上聚合成膜的过程制备微囊。成膜的高聚物有尼龙、聚酰胺及聚脲等。现以尼龙 610 为 例，其基本过程是将含酶的 10血红蛋白溶液与己甲叉二胺水溶液混合，再倾入含有 1Span85 的氯仿-环己烷中分散乳化，加入溶于有机相的癸二酰氯后，便在油水界面上 发生聚合反应，弃去上清后，加入 Tween20 去乳化，洗去有机溶剂及末聚合的单体，将其 转移至水相中即得微囊。 纤维包埋法是将可形成纤维的高聚物溶于与水不混溶的有机溶剂中，再与酶溶液混合并乳 化，然后将乳化液经喷头挤入促凝利(如甲苯及石油醚等)中形成纤维，即成为固定化酶。 （3）交联法制备固定化酶技术 例如 0.2的木瓜蛋白酶和 0.3的戊二醛在 pK5.27.2，0下，24h 即完成反应，反应 速度随温度的升高而增大。若 pH 低于 4.0，即使长时间反应也不能实现酶的固定化。酶晶 体也可以用交联法实现固定化，但在交联过程中酶容易失活。 （4）共价结合法制备固定化酶的技术 共价结合法制备固定化酶的优点是酶与载体结合牢固，稳定性好；缺点是载体需要活化， 固定化操作复杂，反比条件比较剧烈，酶容易失活和产生空间位阻效应。 6.固定化酶的形状与性质 6.1 固定化酶的形状 （1）颗粒状固定化酶（制备方法简单，颗粒比表面积大，转化效率高，适用于各种类型的 反应器） ；（2）纤维状固定化酶（比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器） ； （3）膜状固定化酶/酶膜（表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充 床反应器） ；（4）管状固定化酶/酶管（机械强度大，切短后可用于填充床反应器，也可以 组装成列管式反应器） 。 6.2 固定化酶的性质 （1）酶活力的变化 （2）酶稳定性的变化 稳定性包括：操作稳定性。贮藏稳定性。热稳定性。对蛋白酶的稳定性。 （3）酶学特性的变化。底物专一性。最适 pH。最适温度。米氏常数（K m） 。最 大反应速度（V max） 。 13 7.固定化酶活力的测定方法 三、酶的非水相催化 其催化活性与水溶液中相当，甚至更高，并且具有下列显著特点： （1）提高非极性底物和产物的溶解度，从而提高反应速度。 （2）可催化水解反应的逆反应，而合成（酶类、 ）多肽、酯类等化合物。 （3）有利于反应后酶与产物的分离。 （4）解除或减少某些产物对酶的抑制作用。 （5）提高酶的稳定性。 第七章 发酵工程制药 一、发酵工程与发酵工程制药的发展历史 二、微生物发酵制药的研究范围 微生物菌体发酵：如香菇类、灵芝、金针菇、依赖虫蛹而生有的冬虫夏草菌以及与天麻共 生的密环菌等药用真菌。 微生物酶发酵： 微生物代谢产物发酵： 微生物转化发酵： 第二节 微生物工业用菌种 一、发酵工业对生产菌种的要求 （1）能在易得、价廉的原料制成的培养基上迅速生长，且代谢产物产量高。目标产物最好 能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离。 （2）发酵条件粗放、易于控制，且所需的酶活性高。 （3）菌种生长和发酵速度较快，发酵周期短。 （4）根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变菌株或调节突变菌株或野生菌株。 （5）抗杂菌、抗噬菌体能力强。 （6）菌种纯粹，遗传性状稳定（不易变异退化） ，以保证发酵生产和产品质量的稳定性。 （7）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素以保证安全。 二、工业上常用的微生物 1.微生物的共同特性 （1）个体小、构造简单；（2）容易培养、易于代谢；（3）生长旺盛、繁殖迅速；（4） 适应性强、容易变异；（5）分布广泛、种类繁多。 2.工业上常用的微生物 发酵工业上常用的微生物有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌四大