中性粒细胞碱性磷酸酶

中性粒细胞碱性磷酸酶 （ N-ALP NAP） 碱性磷酸酶包括一组在 PH 中性以上能够从很多醇和酚的单磷酸酯释放出碱的同功酶。 一正常分布： 人体血液与造血细胞的碱性磷酸酶活性，主要存在于中性粒细胞系统的成熟阶段中， 其他成分如嗜酸、嗜碱、淋巴、单核以及巨核细胞，血小板，浆细胞等均为阴性反应，网 状内皮细胞和巨嗜细胞的反应为强阳性。 二生理变化： 1年龄变化：新生儿 ALP 极高，随后下降，成人较儿童期减低，老年期（6）最低。 2性别差异：无差别，但也有报道女男。 3季节变化：夏季为高。 4应激状态下的变化：紧张、恐惧、休克、激烈运动等。 5妊娠期的变化：妊娠 23 个月时。NAP 轻度高。以后逐月趋于显著。 6与激素的关系：肾上腺皮质激素，雌激素和 ACTH 都有使 NAP 活性升高，有人认为 ACTH 的作用是通过肾上腺皮质而发生的。 三临床意义： 1重度增高： 类白血病反应：NAP 活性极度增高与 CML 鉴别。 感染：细菌感染的 NAP 改变比较明显，其中，NAP 活性高度增高者见于各种急性化 脓性感染（如败血症、大叶性肺炎、化脓性脑膜炎等） 。 2中度增高： 感染：见于支气管肺炎、肾盂肾炎。 贫血：AA。 非 AL 性骨髓增生性疾患：PV、骨髓纤维化、CML 合并骨髓硬化症、持发性 ITP、 AL：ALL 。 恶性淋巴瘤：何杰金氏淋巴瘤。 3轻度增高： 感染：上呼吸道感染、肺结核等。网状细胞增高，遗传性低 NAP 症。 AL：MM、神经母细胞瘤。 贫血：溶血性贫血。 4降低： 贫血：镰形细胞贫血和阵发性睡眠性血红蛋白尿。 AL：CML 显著减低 感染：病毒性感染、特别是病毒性肺炎。 5正常或无规律：急粒的 NAP 活性可减低也可正常。并发感染时可有中度升高。当治疗 后充分缓解时，有些 NAP 活性可恢复正常。单核细胞改变缺乏的规律性，绿色瘤和 M6 与急粒相似。 网状细胞肉瘤多数病例增高，少数在正常范围内。 淋巴肉瘤可增高，可正常。MDS 可增高、正常和减低。 主要鉴别： 1CML类白 2PNH AA 3ALLANLL 4PV反应性 PV 5细菌升高病毒（特别是肺炎） 四染色方法： 碱性磷酸酶是一种能分解磷酸酯的水解酶，方法不同，原理不同。国际标准化委员会 提出。推荐的方法应该是快速，简便，容易重复，并有很宽的技术范围。 方法：（1）钙钴法 （2）未取代萘酚法：底物 磷酸萘酚钠。 （3）取代萘酚法：国际标准委员会推荐两种方法: A 1963 年 Kaplow 等：萘 AS-BI 磷酸盐 B 1963 年 Tomonaga 等：萘 AS-MX 磷酸盐 国际标准化委员会认为 萘磷酸盐产生的反应产物。生色团不好，并且是水溶性的， 因此使用这种基质的方法是不满意的，只有考虑应用那些萘磷酸的代用品。适当耦联物的 选择是基于从技术观点看耦联物的特性，及它们是否容易获得，这两个方面。萘 AS-BI 磷 酸盐，结果快。萘 AS-MX 磷酸盐，因为它耗费时间，除日本外其它国家很少了解，但它对 白细胞中酶染色的质量是比较好的。其它细胞化学反应的技术因素，如固定 pH 范围，温 浴时间，温浴介质的缓冲作用等也应予以考虑。国外大都应用萘酚 AS-BI 磷酸。 上海儿研所对三种白细胞碱性磷酸酶染色方法的评价，认为（1）钙钴法平均阳性指数 最低仅 2.12。虽有人主张延长孵育时间以提高阳性率和阳性指数，但由于孵育时间长，易 使阳性产物扩散；且钙钴法的基质液的配制较麻烦，影响其结果的因素很多。 （2）未取 代萘酚法虽然反应时间缩短，阳性指数正常值相对较为稳定，但基质液不能长期保存，每 次需临时配制孵育液。 （3）取代萘酚法较其它方法有以下特点，酶活性显示较充分，正常 值 68%以上可以显示 LAP 活性，阳性指数均值较其它方法高，反应酶的钝化与丢失较少， 阳性产物色泽鲜明，溶解度低，不扩散，因而定位精确，有利于评定 ALP 活性强度的分级， 例三者平均值。 表一 NAP 三种试验方法比较 钙钴法 未取代萘酚法 取代萘酚法 阳性率% 阳性指数 阳性率% 阳性指数 阳性率% 阳性指数 组 别 范围 X（平均） 范围 X（平均） +SD 范围 X（平均） 范围 X（平均） SD 范围 X（平均） 范围 X（平均） SD 高阳性指数组 （N=24） 35-81 68 66-254 21013.5 40-76 70 45.8-154 10117 85-100 93 347-540 450.35 正常阳性指数组 （N=60） 20-39 34 41-82 6218 17-40.5 26 18-69.8 49.520 68-99 84.1 164-380 240.256.2 低阳性指数组 （N=22） 10-40 29 12-84 5720 6-55 40 6-70 4028 40-80 61 24-396 18638 染色方法介绍： 一 钙-钴法： （一）原理：磷酸酶能水解各种磷酸有机盐，并释放出磷酸，组化方法是利用被释放出来 磷酸与 Ca2+结合，成为磷酸钙而沉淀下来，再与硝酸钴与硫化铵作用。生成黑色的 硫化钴。 （二）试剂 1孵育液：3% -甘油磷酸钠 10ml 2% 巴比妥钠 30ml 2% Ca(NO3)2 20ml 2% mgsO4 2ml 混匀，以 0.5NaoH 调 pH 至 9.3-9.4 置 5后即可。 22%巴比妥钠 31%硫化铵 40.5%伊红 50.5%美兰 （三）步骤： DW1g DW 冲 干 干 冲 B 95%乙醇 孵育液 2%硝酸钴 1%硫化铵 5 0.5%伊红 0.5%美兰 镜检 固定 10 376h 干 5 干 冲 冲 干 （四）正常值： 阳性率 阳性指数 B 53.7% 81.96.4 BM 49.2% 84.79.8 此方法阳性率低，时间长，稳定性差，影响因素多，现基本不在采用。 二 偶氮染料法：萘 AS-MX 磷酸盐 （一）原理：底物在 pH 9.5 被 WBC 中酶水解产生磷酸和芳基萘胺，芳香萘胺再与偶氮偶联， 形成不溶性染料。 （二）试剂： 萘酚 AS-MX 磷酸钠盐（sigma） 固兰 RR 冰醋酸 -氨基-2-甲基 1,3 丙二醇 N,N-二甲基甲酰胺 甲醛 甲醇 藏红花红 O a固定剂：取 10ml 甲醛和 0.01ml 冰醋酸，加入到 90ml 甲醇中充分混匀，保存在冰箱、 冰盒中备用。 b贮存缓冲液（0.2M PH 8.6 丙二醇） 取 2.1g-氨基-2-甲基 1,3 丙二醇溶于 4ml N,N-二甲基甲酰胺中，再向此溶液中， 加入 76ml 贮存缓冲液和 120ml DW，混匀放 4冰箱，备用。 C作用液：贮存底物溶液 20ml 固兰 RR 20mg 充分混匀，用前迅速过滤。 d复染液：0.5% 藏红花红 O。 （三）步骤： 水冲 水冲 B 固定剂 作用液 复染液 5 干 2h 干 （四）结果：酶活性呈现为不连续的分散的兰色颗粒，在人中性粒细胞胞浆中，细胞浆染 成浅红色，很少的淋巴细胞可呈现很弱的反应，其它细胞无反应。 （五）分级标准： （-）无燃料颗粒。 （+）5 个燃料颗粒以内。 （+）5 个以上到 30 个可以清楚计数的颗粒。 （+）30 个以上呈不同均匀分布的颗粒。 （+）30 个颗粒以上分布不均匀，颗粒之间可以清楚辨别。 （+）中性粒细胞胞浆内充满于颗粒，且颗粒之间不可清楚辨别。 （六）正常值：阳性率68% 阳性指数 164-380 上海儿研所 80 年进行观察： （一）不同重氮盐的显示效果。从分解速度，产物色泽和无解来说以坚牢兰 RR 所得结果最 好。 重氮盐名称 抑 制 分 解 色 泽 沉淀类型 坚牢紫 B + + 综 红 颗 粒 坚牢兰 BS + -+ 综 黑 明显扩散 坚牢兰 B + + 蓝 黑 清度扩散 坚牢兰 RR + -+ 浓 蓝 颗 粒 （二）不同孵育时间对 LAP 活性的影响从表 3 中可见孵育 2-4h 反应最充分，所以选用 2h。 （三）不同浓度坚牢兰盐 RR 对显示结果的影响。表 4 阳 性 指 数坚牢兰盐 RR 浓度 （mg/ml） 例 数 范 围 均 值 3 8 53-87 71.4 2 8 160-180 172.1 1 8 181-246 205.4 0.5 8 161-270 221.0 0.25 8 141-189 170.1 浓度在 0.5-1mg/ml 时，LAP 活性显示最充分，沉淀物也不扩散。 （四）不同浓度萘酚 AS-MX 对结果的影响。表 5 阳 性 指 数 例号 10mg 7mg 5mg 4mg 2mg 1 154 222 210 220 54 2 52 62 60 50 19 3 333 438 466 443 72 4 380 455 442 450 140 5 58 44 60 52 33 6 162 180 197 193 102 7 206 200 221 166 104 8 170 174 216 222