人sonic hedgehog基因远距离增强子zrs调节基因表达机制的初步研究

论文：人 Sonic Hedgehog 基因远距离增强子 ZRS 调节基因 表达机制的初步研究 【中文摘要】Sonic Hedge 基因在动物个体发育过程中起到形 态发生素的作用,在多种器官和组织形成中发挥效用,如大脑,脊髓, 丘脑,肢芽,上皮组织等,目前研究已经表明,在不同的组织中 shh(Sonic Hedgehog)基因的表达是由不同的增强子序列调节起作用 的。在肢芽中,shh 的表达受到距离其上游 1Mb 远的一段保守序列 ZRS (ZPA regulatory sequence)的调节,而当该序列内部出现点突 变时,shh 在肢芽部分的表达会发生变化,从而导致轴前多指畸形 (PPD)这种严重遗传病的出现。ZRS 序列本身非常保守,在人、小鼠、 大鼠、鸡、河豚中,目前已经有报道 10 个以上的点突变会引发肢芽 部分的发育异常。本实验从病人样本的基因组中筛选到了一个没有 被报道过的点突变(3CG),PCR 扩增了两种长度的含有点突变的 DNA 序列,并通过使用荧光素酶报告基因活性检测系统,在 HEK-293A 细胞 中,发现具有点突变的 ZRS 序列和野生型的 ZRS 序列均具有增强子活 性,而且活性是突变型的高于野生型的序列。对于这个突变体的生物 信息学分析发现,该点突变可能会改变这段增强子序列的转录因子结 合位点,因此使 Shh 基因的表达出现了异常。. 【英文摘要】Sonic Hedgehog works like a morphogen during the animal individual development. It functions in many organs, such as brain, spinal cord, thalamus, limb bud and epithelial cells. Recently reports show that in different tissues, different tissue specificity enhancers regulate shh expression. During limb bud shaping, the conserved ZRS sequence locating IMbp upstream of the shh proximal promoter regulates shh expression as a long-range enhancer. And point mutation in this ZRS sequence would cause the preaxial p. 【关键词】 【英文关键词】Sonic hedgehog ZRS DAPA Luciferase Reporter Assay System Point Mutation 【索购全文】联系 Q1：138113721 Q2：139938848 【目录】人 Sonic Hedgehog 基因远距离增强子 ZRS 调节基因表 达机制的初步研究 中文摘要 4-5 Abstract 5-6 缩略词 10-11 第 1 章 前言 11-16 1.1 Sonic Hedgehog 基因简介 11-13 1.2 shh 基因表 达调控模式简介 13-15 1.3 本课题的实验目的、意义 和研究策略 15-16 1.3.1 实验目的和意义 15 1.3.2 研究策略 15-16 第 2 章 实验材料和方法 16-29 2.1 实验材料 16-19 2.1.1 菌种和 载体 16 2.1.2 人血液样本 16 2.1.3 细胞系和细胞培养基 16 2.1.4 工具酶,试剂(盒) 16-17 2.1.5 试剂的配制 17-19 2.2 实验 仪器 19 2.3 实验方法 19-29 2.3.1 提 取质粒 DNA 20 2.3.2 切胶回收 DNA 20-21 2.3.3 纯化 PCR 产物及酶切产物 21-22 2.3.4 提取血 液中的基因组 DNA 22-23 2.3.5 连接反应 23 2.3.6 质粒 DNA 及连接产物转化感受态细胞 23-24 2.3.7 菌落 PCR 鉴定阳性克隆 24 2.3.8 SDS-PAGE 电 泳 24-25 2.3.9 细胞复苏 25-26 2.3.11 细胞冻存 26 2.3.12 细胞计数 26-27 2.3.13 HEK-293A 细胞转染 27 2.3.14 双荧光素酶报 告基因检测系统 27-29 第 3 章 ZRS 点突变的筛选 29-36 3.1 从病人样本中调取 ZRS 序列并测序分析 29-32 3.1.1 实验材料 29 3.1.2 方法,结 果及分析 29-32 3.1.2.1 从病人血液样本中抽提基因 组 DNA 并进行定量 29 3.1.2.2 从提取的基因组中克 隆带有 ZRS 序列的 DNA 片段 29-31 3.1.2.3 4 个病患 样本中有 2 个出现了点突变 31-32 3.2 病人样本基因 组 shh 基因外显子序列的测序分析 32-34 3.2.1 实验 材料 32 3.2.2 方法、结果及分析 32-34 3.3 表型正常人的 ZRS 序列突变分析 34-35 3.3.1 实 验材料 34 3.3.2 方法、结果及分析 34-35 3.4 小结 35-36 第 4 章 双荧光素酶报告系统检测 ZRS 突变型和野生型的增强子活性 36-46 4.1 构建 pGL3-promoter-ZRS/BLZRS 质粒 36-40 4.1.1 实验材 料 36 4.1.2 方法,结果及分析 36-40 4.2 转染 HEK-293A 细胞并检测荧光素酶活性 40-45 4.2.1 实验材料 40 4.2.2 方法,结果及分析 40- 45 4.3 小结 45-46 第 5 章 生物素标记 ZRS 特异性捕获与其作用的蛋白质 46-56 5.1 实验材 料 46 5.2 方法,结果及分析 46-56 5.2.1 制备带有生物标记的 DNA 探针并验证标记效率 46-48 5.2.2 获取 HEK-293A 非变性细胞核蛋白并定量 48-50 5.2.3 DAPA(DN