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结核菌培养方法、耐药性及存活时间的研究 【论文摘要】：目的：了解 Dipasic 对耐药菌株是否有效及其药物抑菌浓度。方法： 药敏培养基内加入10种不同浓度抗结核药物，加入结核菌菌液10-3毫克。结果：四周后观 察三种抗结核药物耐药情况。结论：DPC 是一种独立的抗结核药物对耐药结核菌都有效， 但在1g 浓度时仍有30%生长，认为用药量量应加倍。 【关键词】：结核菌培养方法 结核菌耐药性 结核菌存活时间 结核菌试验 【论文】：抗结核药物的使用，在结核病防治上起了划时代的作用。50年代采用 INH+PAS 联合治疗，取得了较好疗效。但 PAS 服用量大，消化道反应多，病人不能耐受， 90%不能完成治疗程。瑞士 Geistlich 药厂研制的 Dipasic（简称 DPC） （德国又名 GEWO399） ，是以特殊方法，将 INH 与 PAS 合成的化合物。它能代替 INH+PAS 联合用药， 增加疗效，副作用明显比 PAS 为少，德国 Freudenthal 等50余位专家均有 Dipasic 临床应用 的报告，认为有效。但无 Dipasic 耐药性的报道。当前，我国耐药性病人不断增加，寻求 合理用药，是当务之急，为此我们对 Dipasic 作耐性研究，目的在于， （1）了解 Dipasic 对 耐药菌株是否有效？（2）Dipasic 的药物抑菌浓度如何？以便研究用量与用法，提高临床 疗效。1、研究方法：【纳入标准】从安徽医科大学附属医院的门诊及病房肺结核病人的痰 进行结核菌培养，无论病人是初治抑复治，亦不分男女老少，凡痰菌培养阳性者，即作为 研究对象。结核菌的检验，按标准常规操作进行。药敏培养基的制备：液体鸡蛋培养基内， 按比例加入抗结核药物，其浓度按我国药敏标准，如 INH、PAS 、TB1，每毫升分别为1g 及10g， SM、KM、CPM 分别为10g，RFP 及 RFD 分别为 50g 及250g，EMB 为5g 及 50g。Dipasic 则暂定为每毫升含药0.1g、0.5g、1.0g 及10g 四种。加入药物后，充分 摇匀混合后，分装在中试管内，每管5毫升，摆成斜面，进行8590一小时凝固灭菌， 24小时后再灭菌一次，制成的含药培养基，保存在冰箱，一个月内有效。菌液制备：取培 养基上生长一个月内的菌落，于磨菌器内灭菌生理盐水研磨呈均匀的菌液，再加灭菌盐水 稀释，与标准管比较（制成每毫升含1毫升的菌液） ，最后100倍稀释成每毫升含10-2毫克菌 液备用。菌液接种：将含不同浓度的含药培养基顺序排列，并有不含药物的培养基作为对 照。取每毫升含10-2毫克的菌液，每管接种 0.1毫升，接种菌量为10-3 毫克的菌液。放在 37温箱内培养，每周观察一次，四周报告结果。报告的标准是， 【诊断标准】如培养基上 无菌生长者为（一） ，培养基上有菌落数在50个以下者为（+） ，培养基上菌落数50个以上， 但无融合者为（+） ，培养基上菌落大部分融合者为（+） 。2、研究结果：我们研究的10 种抗结核药物耐药性试验，这10种抗结核药物是： INH、PAS、DPC、TB1、EMB、RFP、RFD、SM、KM 及 CPM，围绕本文目的，我们仅 取30例病人的其中 INH、PAS 及 DPC 三种药物的耐药性进行分析，其他另行报道。 INH、PAS 的浓度，按国家耐药性标准， 【样本含量】分为1g 及10g，以每毫升1g 为耐 药上界，1g 药浓下不能生长者为阴性，为敏感菌。1g 生长者为阳性，为耐药菌。DPC 的浓度，由于我们尚需寻求合适的抑菌浓度，故分为每毫升含药0.1g、0.5g、1.0g 及 10g 四种不同的浓度。为便于统计比较，暂以1g 作为耐药标准，1g 以下者为敏感，1g 以上者为耐药。 表1 30例耐药情况分析 培养结果 INH（%） PAS（%） DPC（%） 敏感 3（10.0） 22(73.3) 20(66.6) 耐药 27(90.0) 8(26.7) 10(33.4) 从表1可见耐 INH 菌珠已达90%,耐 DPC 菌株为33.4%,经统计学处理,X2=27.44,P0.001,有 高度显著性。PAS 与 DPC 比较，经统计学处理，校正卡方为0.062，P 0.05,无显著性。 表2 敏感与耐药程度的分析 培养结果 INH PAS DPC （一） 3(10.0%) 22(73.4%) 20(66.6%) 1(3.3%) 2(6.6%) 3(10.0%) () 4(13.3%) 3(10.0%) 6(20.0%) () 22(73.4%) 3(10.0%) 1(3.3%) 表 1 和表 2 可以说明 INH、PAS、DPC 为三种不同的抗结核药物，他们对不同的结核菌， 有不同的敏感与耐药情况。从 8 例耐 PAS 菌株中，我们发现，此 8 例同时有三种以抗结核 药物之耐药，耐 DPC 菌株 10 例中，也有此一现象，是多种耐药性菌株。 表 3 30 例 DPC 抑菌浓度的分析 抑菌浓度（g ） 培养阳性 培养阴性 01 30（100%） 0（0%） 05 18（60%） 12（40%） 10 9（30%） 21（70） 100 2（6.6%） 28(93.4%) 从表 3 可见,DPC 抑菌浓度,1g 尚有 9 例培养仍可生长,10g 时有 6.6 培养阳性。 3、讨论：过去，有人认为 DPC 是一种 INH+PAS 的混合物，我们的研究证明从耐药性及 耐药程度分析，DPC 是独立的一种抗结核药物，是 INH 与 PAS 的一种化合物，当前，我 国耐 INH 菌株已达 90%，这样的耐药性，仍在广泛应用，是否降低疗效，值得重视。INH 耐药后，是否致病力全均下降，从我们的结核菌培养后生长时间看，并未发现耐药菌的生 长延缓。比统计学看来，耐 INH 菌株，应用 DPC 仍有效，差异有高度显著性。因此， DPC 可否作为另一种抗结核药物，与 RFP、RFD 等联合应用，关键在于 DPC 是否和 PAS 那样，对 RFP、RFD 吸收有障碍，会降低 RFP 的血浓度，降低疗效。如果 DPC 并没有 PAS 这一代谢现象，则 DPC 作为另一抗结核药物，其应用前景就较为广阔了。Kowilsky 氏测定 DPC 服用后血浓度的记载，氏用 DPC 与 INH 同量时，血浓度 1 小时 5.8mg/L,3 小 时 6mg/1,7 小时 4.56mg/L,12 小时 2.6mg/L,14 小时 2mg/L，氏认为 DPC 明显优于 INH，其 优点是：（1）DPC 排泄慢，INH12 小时血浓度仅有 0.003mg/L，而 KPC 仍有 2.6mg/L，14 小时时 INH 浓度已为”0”，KPC 仍高达 2mg/L。 （2）血浓度 KPC 比 INH 高，在二者给同样 的药量时，INH 血浓度为 5.2mg/L，DPC 则为 5.8mg/L。从 Wilbrandt 氏1LD50 的研究中， DPC 对小白鼠及兔的 LD50 一倍于 INH，每公斤体重达 0.4mg，因此 DPC 的毒性是很小的， 应用大于 INH 一倍的用量是完全可以耐受的。从我们的研究中，也可以看出，DPC 和 INH 同样的 1g 耐药性分界线是不够的，1g 有 30%阳性，要提高疗效，加大用量，似属必要。 也就是说，INH 每日常规用量 6mg/kg，DPC 用量应为 12mg/kg，或更