基于pcr的cdna基因克隆技术研究进展

基于 PCR 的 cDNA 基因克隆技术研究进展 蔡欣 1 陈宏 2, 3 汪虹英 4 (1.西北农林科技大学生命科学院，陕西省农业分子生物学重点实验室, 杨凌 712100; 2. 西北农林科技大学动物科技学院，陕西省农业分 子生物学重点实验室, 杨凌 712100; 3. 徐州师范大学生物技术研究所, 徐州 221116; 4. 甘肃省漳县一中, 甘肃漳县 748300) 摘要 RT-PCR、single-sided(anchored) PCR、RACE 以及 step out RACE、DDRT-PCR、cDNA RDA、SSH 等都是建立在 PCR 基础之上的 cDNA 分子克隆技术，本文介绍各种技术的优缺点、应用以及与同类技术进行比较，这些技术现在已经成 功应用于大量 EST 的分离、cDNA 文库的构建、编码产物未知的差别表达基因的分离以及全长 cDNA 基因序列的克隆等方 面。 关键词 cDNA 基因克隆; PCR; 特点；应用 中图分类号:Q 7 Research Progress on PCR-based Techniques of cDNA Gene Cloning CAI Xin1 CHEN Hong2, 3 WANG Hong-ying4 (1College of Life Science, Northwest Sci-tech University of Agriculture and Forestry, Shaanxi Key Laboratory of Agriculture Molecular Biology, Yangling, Shaanxi 712100 China; 2 College of Animal Science and Technology, Northwest Sci-tech University of Agriculture and Forestry, Shaanxi Key Laboratory of Agriculture Molecular Biology, Yangling, Shaanxi 712100,China; 3. Institute of Biotechnology, Xuzhou Normal University, Xuzhou, Jiangsu 221116,China; 4 the First Middle School of Zhangxian County, Zhangxian, Gansu 748300,China) Abstract: RT-PCR, single-sided(anchored) PCR, RACE, step out RACE, DDRT-PCR, cDNA RDA and SSH are all the techniques of cDNA cloning based on PCR. The advantages and disadvantages of each technique were dicussed and compared with those of their counterparts. These techniques are now successfully used in the fields of isolation of numerous ESTs, construction of cDNA libraries, obtaining of differentially expressed new genes and cloning of cDNA in full length. Keywords: cDNA gene cloning; PCR; characteristics; applications Kary Mullis 等在 1983 年发明的 PCR 技术 1现在已经成为分子生物学及其相关领域的经典实验方法， 目前由 PCR 技术衍生出许多重要的相关技术，它们在基因克隆、基因测序、基因检测、基因改造以及突 变分析等分子生物学以及其它生命科学研究中具有重要的应用价值；目前有许多 cDNA 基因克隆方法主 要是建立于 PCR 及其衍生技术之上的，原有技术被不断改进、新的技术被不断发明，它们在 cDNA 文库 的构建、EST 的分离、cDNA 基因克隆、新基因的分离、基因表达的检测分析等研究领域发挥着重要的作 用。 1 RT-PCR 当我们期望从某一序列已知的 mRNA 克隆 cDNA 时，就可以利用 RT-PCR(reverse transcription PCR)， 即逆转录 PCR 方法,其原理是由 mRNA 通过逆转录反应产生的 DNA 链作为模板进行常规 PCR 扩增 2。由 于 RT-PCR 的放大作用和很高的敏感性，所以具有显著的优点：首先，该方法不需要纯化 mRNA，总 RNA 就可以作为合成单链 cDNA 的模板，因而避免了纯化过程中 mRNA 的降解以及丢失；其次，该方法 中单链 cDNA 合成后其 3末端要进行同聚物加尾，不会丢失末端的最后几个核苷酸，所以可以获得相当 于 mRNA 5末端的比较完整的序列，其中也包含着未知序列的 cDNA 群体 3。RT-PCR 还可以用于检测 mRNA 分子，PCR 测序以及探针的制备等。 项目基金 国家 863 项目(2001AA243052，2003AA243051),国家自然科学基金（30471238） ，中华农业科教基金（99-03-A-5）资助 2 作者简介: 蔡 欣 (1973)，男，甘肃漳县人, 博士生，专业：生物化学与分子生物学 通讯作者: 陈 宏(1955 )，男，陕西长安人, 博士生导师，教授，研究方向：生物技术与动物分子遗传学 2 single-sided(anchored) PCR 利用 RT-PCR 方法进行 cDNA 基因克隆时，首先需要有 mRNA 或 cDNA 的全长序列资料，以便根据 其设计合适的引物，然后才能进行目的 mRNA 或 cDNA 全长序列的扩增；而在实际工作中，我们往往获 得到的是 mRNA 或 cDNA 的部分序列，如欲获取其全长序列信息，可以选择采用 single-sided(anchored) PCR, 即单侧 (锚式) PCR。基本原理是根据已知的 mRNA 或 cDNA 部分序列设计基因特异性引物(gene- specific primer, GSP), 同时利用寡聚胸腺嘧啶核苷酸 oligo (dT)作锚定引物，进行已知序列上游序列或者下 游序列的 PCR 扩增 4。本方法适合于根据已知 cDNA 部分序列来扩增 cDNA 全长序列，在进行 PCR 扩增 时除了设计的基因特异性引物(GSP)之外，还需要一条锚定引物 oligo (dT)20，如果与待扩增的 cDNA 相应 的 mRNA 不具有 Poly(A)尾，此方法就不适用。理论上讲，锚式 PCR 只需要一条基因特异性引物(GSP) ， 但是在实际工作中为了提高扩增的特异性，常常需要设计第二条特异性引物进行第二轮 PCR 扩增，第二 条特异性引物可以与第一条引物相邻或者部分重叠。 3 RACE RACE(rapid amplification of cDNA ends)，即 cDNA 末端的快速扩增，也是一种根据已知部分 cDNA 序 列扩增未知序列的 PCR 技术 , 其基本原理是：首先根据已知的 cDNA 部分序列设计 GSP, 以 mRNA 为模 板 逆转录合成单链 cDNA，再通过常规 PCR 扩增出从已知核苷酸序列内某一特定位点到 3末端或者 5末 端之间的未知核苷酸序列，所以又可以分为 3RACE 和 5RACE 5。 3RACE 可以利用 mRNA 的 Poly(A)尾设计锚定引物；但是进行 5RACE 时，先要将合成的第一条 cDNA 链 3末端加上同聚物尾， 再根据其设计锚定引物。 4 step out RACE 常规的 RACE 存在着步骤繁多、费时和特异性比较低等缺点。后来 Matz6及其合作者在 RACE 方法 的基础上，根据 PCR 抑制作用 (PCR-suppression effect, PS-effect) 7和 cDNA 合成过程中存在的模板转辙作 用(template-switching effect, TS-effect)8, 同时采用了 touchdown PCR 技术 9，将 5RACE 和 3RACE 方法进行了改进，显著提高了灵敏度和扩增的效率，降低了扩增背景，将这种 cDNA 末端的快速扩增技 术称为 step out RACE，翻译为“越轨”RACE 。此技术利用鼠白血病病毒莫勒尼株(Moloney murine leukemia virus，MMLV)逆转录酶在 cDNA 新链的合成到达 mRNA 模板的 5末端时能够将若干个非模板 的核苷酸( 主要为 dC)聚合到新合成 cDNA 链的 3末端的特性，实现模板转辙作用；PCR 扩增过程中过 加入一对大小不同的 SO-PCR(越轨 PCR)引物，小引物与大引物的 5端部分序列重叠，而大引物的 3 端序列与 TS-oligo(模板转辙-寡聚核苷酸)的大部分序列重叠，则经过一轮 PCR 反应形成的 DNA 双链分子 的各条单链都形成“锅柄”样(panhandle-like)结构而不能进行后续 PCR 扩增，进而实现 PCR 抑制作用。 他们利用此项技术对人胎盘中的 13 种 mRNA 进行了检测，其中丰度最低的相应于干扰素 受体和白细 胞介素 10 的 cDNA 5和 3 末端都被成功扩增。虽然 step out RACE 技术与同类的 RACE 技术 5相比较 具有操作简便、高效和灵敏的特点，但是它还是解决不了由于 RT 反应造成的 RACE 技术普遍存在的问 题，如 mRNA 很长或者形成稳定的二级结构而致使合成的 cDNA 完整性降低等。邱为民等人 10根据已知 的 EST 序列设计引物，通过 step out RACE 技术成功地克隆出了三个人类精子发生相关基因的全长 cDNA 序列。 5 DD-PCR 或 DDRT-PCR 生物的发育、细胞的分化、细胞的周期变化、生物体对外界环境压力的反应以及细胞的凋亡和个体 的衰老等所有的生命过程都可以归结于基因的差别表达，因此比较不同细胞或者不同基因型在基因表达 上的差异，即 mRNA 种类的差别为我们深入了解生命过程的本质打开了方便之门 11。虽然应用传统的 mRNA 差减杂交和扣除杂交技术也分离到了一些重要的基因, 但是这两种方法存在费时费事、重复性差、 3 难以适应成批样品的检测研究等。在 PCR 技术发展的基础上，1992 年美国波士顿 Dena-Farber 癌症研究 所的两位科学家 Liang 和 Pardee12发明了 DD-PCR(differential display mRNA by PCR)或 DDRT- PCR(differential display reverse transcription PCR)技术，即 mRNA 差别显示 PCR 或者差别显示反转录 PCR 技术，在一定程度上克服了差减杂交和扣除杂交技术的不足之处。虽然该技术克服了差减杂交和扣除杂 交技术的缺点，但是仍然存在着工作量大、成本高、假阳性率高、重复性差以及分离的 cDNA 片段比较 短小等不足之处。 6 cDNA RDA 为了克服 mRNA 差别显示技术在实际应用中存在的不足之处，1994 年, Hubank 和 Schatz13在 Lisitsyn14等人发明的基因组代表性差示分析(representational difference analysis, RDA)技术基础上，发展了 一种称为 cDNA 代表性差示分析技术, 简称 cDNA RDA。此方法保留了差减杂交和 DD-PCR 的精华，同 时充分发挥了 PCR 反应以指数形式扩增双链模板、以线性形式扩增单链模板这一特性，并通过降低 cDNA 群体复杂性和多次更换 cDNA 两端接头等方法，特异地扩增目的基因片段, 与 DD-PCR 相比具有假 阳性低、特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。Hubank 等人通过此项技术成功地从小鼠成纤维细胞系 TXH8 中分离到了两个重组激活基因(recombination activation gene)RAG-1 和 RAG-2 的编码序列，同时还 从一个经咖啡因诱导的小鼠前 B 细胞系 1-8 中克隆到了胰岛素样生长因子 1B(insulin like growth factor, IGF-1B)基因和与天然杀伤细胞抗原(natural killer cell antigen)基因 NKR-P1 类似的编码序列。但是令人遗 憾的是，cDNA RDA 技术美中不足，也存在着操作复杂、实验周期长以及费用高等缺点，为此刁丰秋 15 等人对此技术作了若干重要的改进，使实验程序大大简化。改进后的 cDNA RDA 技术可以用于高等动植 物与发育相关以及其它差别表达的未知基因编码序列的克隆。 7 SSH SSH(suppression substractive hybridization), 即抑制性消减杂交技术，是由 Diatchenko16等人在 PCR 抑制作用 7的基础上所创建的，是继 DD-PCR 和 cDNA RDA 技术之后又一新的表型克隆技术。减数 cDNA 杂交技术 1719及其改进的技术是分离和鉴定差别表达基因的 cDNA 序列的强有力的工具，曾成功 地应用于许多重要基因的鉴定，例如 T-细胞受体基因 20鉴定，但是对于低丰度表达的基因却无能为力， 这些技术需要 Poly(A) RNA 的量为 20g 以上，还具有操作繁杂，实验周期长以及费用昂贵等不足之处； cDNA 代表性差示分析技术(cDNA RDA)中虽然不需要分离单链 cDNA(ss cDNA)和双链 cDNA(ds cDNA)， 并且被成功地应用于差别表达 cDNA 的克隆，但是由于各种 mRNA 的丰度存在着广泛的差异，所以在技 术环节中仍然避免不了多重减数杂交；mRNA 差别显示 PCR 技术(DD-PCR) 和随机引物 RNA 指纹分析技 术 21尽管能够快速鉴定差别表达的基因，然而这两种方法都假阳性率高 22,23，对于高丰度的 mRNA 分析 效果好 24，并且不适合于分析差别表达数目比较少的基因 22。与上述技术相比，SSH 具有突出的优点。 首先，SSH 通过两轮减数杂交和 PCR 特异性扩增，假阳性率被大大降低，提高了真阳性率)；其次，SSH 利用了杂交二级动力学的原理，使低丰度差异表达 mRNA 目的序列得到了均等化和富集，降低了背景， 提高了灵敏度；最后，SSH 技术环节中不需要分离单链 cDNA 或者双链 cDNA 成分，只需要经过一轮减 数杂交就可以使低丰度差别表达的基因序列富集 1,000 多倍，分离高、低丰度表达的基因都具有很高的效 率，而且操作简便。SSH 技术适用于分离和鉴定与疾病、发育、组织特异性等相关的差别表达基因。von Stein 等人 25利用 SSH 技术通过转移性肺癌细胞系 Bps73-ASML 与非转移性肺癌细胞系 Bps73-AS 之间的 减数杂交成功地分离到了 625 个差别表达的 cDNA 序列，其中 92 个与已知基因序列具有 100 %或者近乎 100%的相似性，281 个与人类或者小鼠已知基因的相似性在 60%95 %之间，其余 252 个在 GeneBank 中 没有同源序列。利用 SSH 技术，北京大学人类疾病基因研究中心在人前单核细胞 U937 细胞中分离出 1 种新型细胞因子，命名为趋化素样因子(chemokine-like factor 1,CKLF1) 26。在此基础上，进一步运用生物 信息学的方法，发现与 CKLF 有同源性的其它 8 个新基因，分别命名为趋化素样因子超家族成员 1- 8(chemokine-like factor super family member 1-8，CKLFSF1-8)。徐德全等人 27通过 SSH 技术成功构建了梅 山猪与长白猪肌肉组织间正反向减数 cDNA 文库，特异于两种肌肉组织的差异表达基因的富集效率分别 为 210 和 25 倍，从中分别筛选到了 709 和 673 个阳性克隆，插入片段的长度主要分布于 150bp750 bp 之 4 间。 8 结束语 cDNA 基因文库的构建或基因的克隆中，应该根据实验的具体要求，考虑各种技术的优点以及局限 性,选择相应的一种或者几种克隆方案。RT-PCR 虽然操作简单，但是我们首先必须已知待扩增序列或者 其同源序列以便设计引物，而且由于种种原因所获得到的往往是部分序列；而单侧(锚式) PCR 、RACE 及其改进技术 step out RACE 可以弥补 RT-PCR 技术的不足，根据已获得的 cDNA 部分序列能够有效扩增 其上下游序列，经过拼接可以获得 cDNA 全长基因序列。主要建立于差减杂交技术之上的 DDRT- PCR、cDNA RDA 和 SSH 都充分利用了 PCR 反应以指数形式扩增双链模板、以线性形式扩增单链模板 这一特性，它们在差别表达新基因的分离、鉴定以及减数 cDNA 文库的构建等方面具有广阔的应用前景。 step out RACE 对 RACE 作出了重大的改进，SSH 相对 DDRT-PCR 和 cDNA RDA 具有明显的优点，但是 任何技术都不是十全十美的，step out RACE 和 SSH 也具有局限性，然而当今分子生物学技术的发展日新 月异，现有的各种 cDNA 基因克隆技术一定会得到改进，而且还会不断涌现出许多分子克隆的新技术。 参考文献 1 Mullis K B, and Faloona F. 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