基因突变的蛋白质效应

母源性 3-甲基巴豆酰辅酶 A 羧化酶缺乏症临床及基因突变分析 【摘要】 目的 报告 5 例母源性 3-甲基巴豆酰辅酶 A 羧化酶缺乏症（maternal 3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency，MCCD） ，通过基因突变分 析证实其临床诊断。 方法 将串联质谱新生儿筛查发现 3-羟基异戊酰肉碱 （C5-OH）增高的 5 例新生儿及其母亲纳入研究。用尿气相色谱质谱分析进行 MCCD 临床诊断；基因突变检测及功能分析明确诊断。 结果 （1）发现 5 例 无症状母亲血 C5-OH 浓度明显增高，尿 3-羟基异戊酸、3-甲基巴豆酰甘氨酸增 高，诊断为良性 MCCD。其新生儿血 C5-OH 浓度增高，3 例随访后浓度逐步下 降或达正常。 （2）发现 4 种 MCCC1 基因新变异：c.ins1680A（25%） 、 c.203CT/p.A68V、c.572TC/p.L191P、c.639+5GT 和 2 种 MCCC2 基因突变 c.1406GT/p.R469L（新变异）及 c.592CT/p.Q198X。新变异可能影响蛋白结 构和功能。结论 对筛查血 C5-OH 增高的新生儿母亲应常规检测以诊断母源性 MCCD。MCCC1 基因突变多见。 【关键词】3-甲基巴豆酰辅酶 A 羧化酶缺乏症；3-甲基巴豆酰辅酶 A 羧化酶； 基因突变；质谱分析 3-甲基巴豆酰辅酶 A 羧化酶缺乏症（3-Methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency，MCCD）（OMIM 210200/210210）是一种亮氨酸代谢障 碍所致的常染色体隐性遗传的有机酸代谢缺陷病，1970 年由 Eldjarn 等首次报 道 1。因基因 MCCC1（MIM*609010）或 MCCC2（MIM*609010）突变导致亮 氨酸代谢途径中 3-甲基巴豆酰辅酶 A 羧化酶（3-Methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase，MCC）缺乏，3-甲基巴豆酰辅酶 A 不能转化成 3-甲基戊烯二酰辅 酶 A 而堆积，导致血 3-羟基异戊酰肉碱（3-hydroxy-isovalerylcarnitine ，C5- OH）增高、尿 3-甲基巴豆酰甘氨酸（3-methylcrotonyl-glycine ，3-MCG）和/ 或 3-羟基异戊酸（3-hydroxy isovalerate，3-HIVA）代谢产物增多。患者的临床表 型变异较大，多数无症状，少数可表现为严重的神经系统受损 2。 部分发达国家于 20 世纪 90 年代初应用串联质谱（tandem mass spectrometry， MS/MS）开展新生儿筛查，统计显示 MCCD 发生率约为 1/36 0002-4。国内研究相对滞后，我们自 2003 年起率先在国内开展 MS/MS 新生儿 筛查，对血 C5-OH 浓度增高的新生儿，常规对其父母进行 MS/MS 分析，迄今 已发现 5 例母源性 MCCD。而国内除个别 MCCD 病例报道外 5-6，尚未见母源 性 MCCD 及基因研究报道。本文报道 5 例母源性 MCCD 临床、生化表型及转 归，以及基因突变分析结果，以从分子生物学水平证实其临床诊断。 1 对象与方法 1.1 对象 2003 年至 2012 年 9 月，我们对 491 700 名新生儿采用 MS/MS 进行 遗传代谢病筛查，发现 60 余例新生儿血 C5-OH 浓度高于正常切值 0.6 mol/L，对其父母进行 MS/MS 分析，发现 5 例母亲（22 31 岁）血 C5-OH 浓 度明显增高（5.11 21.77）mol/L，其中 4 例伴游离肉碱（free carnitine，C 0） 降低（2.6 6.76）mol/L 。5 例母亲平素体健、孕期及分娩均无临床症状；分 娩的新生儿筛查时血 C5-OH 浓度增高（1.63 11.43）mol/L，临床无症状（表 1） 。 1.2 方法 1.2.1 临床诊断及随访：（1）采用尿气相色谱质谱仪（gas chromatography mass spectrometry，GC/MS）对血 C5-OH 增高相关的有机酸代谢病进行诊断与 鉴别诊断；（2）生物素酶活性测定以排除生物素酶缺乏；（3）生化检测包括 乳酸、血氨、肝肾功能、血气、酮体等；（4）每 3 月 1 年对 5 例新生儿随访， 评估临床症状、生长及智能发育等，复查血 MS/MS、尿 GC/MS，了解临床转 归。 1.2.2 基因分析 基因突变检测 在知情同意的原则下，采集外周血抽提父母及新生儿、 50 个正常对照者基因组 DNA；参考文献7和 Primer Premier 5 软件设计引物， 扩增 MCCC1 基因 19 个外显子和 MCCC2 基因 17 个外显子及两端内含子序列； 按常规方法和反应条件进行 PCR 扩增、测序，Chromas 软件进行突变分析（参 考 MCCC1 GenBank：NM_020166.3；MCCC2 GenBank：NM_022132.4）。 基因新变异分析：（1）正常对照者 100 个等位基因的相关片段测序分析 以排除多态性可能。 （2）PCR-限制性片段长度多态性分析（ PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）：采用 BstX、AlwN两种限制 性内切酶对 c.203CT/p.A68V、c.572TC/p.L191P 错义突变酶切分析。 （3）逆 转录 PCR 测序：提取患者 RNA，经试剂盒 TaKaRa PrimeScript RT Master 逆转 录成 cDNA 进行测序分析，以验证剪切突变 c.639+5GT。 （4）采用软件 Clustal（1.81）对不同物种 MCCC1 和 MCCC2 氨基酸序列比对分析，以了解新 型错义突变位点氨基酸的保守性。 （5）PolyPhen- 2（http//pph2） 、SIFT（/） 、 UniProt（/）和 PDB（/pdb/home/home.do）软件分析新变异是否对蛋白质的 结构和功能产生影响。 2 结 果 2.1 临床诊断及随访 2.1.1 母亲 MCCD 诊断 5 例母亲血 MS/MS 检测结果显示 C5-OH 浓度增高或 伴 C0 降低，血异戊酰烯肉碱、丙酰肉碱、丙酰肉碱/乙酰肉碱浓度均正常；4 例尿 GC/MS 结果显示 3-MCG 增高为 2.18 272，3-HIVA 增高为 3.86 499（表 1） ，无 3-羟基丙酸、甲基枸橼酸、3-羟基-3-甲基戊二酸、3-甲基戊烯 二酸、2- 甲基-3-羟基丁酸及酮体等排出；生物素酶活性正常；根据上述排除其 它 C5-OH 增高相关的有机酸代谢病，结合临床无症状，诊断为良性 MCCD。 2.1.2 子女诊断及随访 5 例新生儿筛查时血 C5-OH 浓度（1.63 11.43） mol/L，出生 2 周召回时降至（ 1.01 9.37）mol/L（下降 36.14%） ，2 例尿 GC/MS 分析显示 3-HIVA 或 3-MCG 略高，结合临床无症状、生化检查正常， 诊断为母源性 MCCD。例 1 和例 2 分别于生后 2.2 岁及 4 月随访时，血 C5-OH 降至正常；例 4 生后 1.5 月末次随访时，血 C5-OH 由 11.43 mol/L 降至 5.81 mol/L（下降 49.17%） ；例 2 生后 3 周复查尿 GC/MS 时，尿 3-HIVA 降至正常； 例 4 尿 3-MCG 仍微量排出；余 2 例未复查血尿。所有新生儿末次随访年龄（1- 38）月时仍无临床症状，生长及智能发育正常。 2.2 基因分析 2.2.1 基因突变 4 例母亲及子女接受了基因分析：突变检出率为 87.5%（7/8 ） ； 共检出 4 种 MCCC1 突变：其中 c.ins1680A 突变频率最高，占 25%（2/8 ） ，其 他 3 种为 c.203CT/p.A68V、c.572TC/p.L191P 以及 c.639+5GT，均未见报道。 共检出 2 种 MCCC2 突变：c.1406GT/p.R469L （未报道）及 c.592CT/p.Q198X（已报道） 。 4 例子女均携带来源于母亲的一个杂合突变。 （表 1，图 1） 表 1 5 例 MCCD 母亲及子女生化和基因突变结果 血 C5-OH 浓 度 血 C0 浓度 尿 3-HIVA 尿 3-MCG 母突变 1 母突变 2 病例 母 子/女 母 子/女 母 子/女 母 子/女 核苷酸改变 突变效果 核苷酸改变 突变效果 子女突变 子女转归（C5-OH 浓度） 1 17.16 4.66 6.76 ND 499 N 60 N c.203CT* p.A68V* c.ins1680A* 插入突变 同突变 1 2.2 岁降至正常 2 5.11 1.63 N N 20.3 8.7 2.18 N c.572TC* p.L191P* c.639+5GT* 剪切突变 同突变 1 4 月降至正常 3 5.62 2.34 6.55 ND 3.86 N 35 N c.592CT p.Q198X c.1406GT* p.R469L* 同突变 1 未随访 4 21.77 11.43 4.36 N 12.59 N 272 1.33 c.ins1680A* 插入突变 同突变 1 1.5 月下降 49 % 5 10.99 4.85 2.6 N ND N ND N ND ND ND 未随访 正常值 T 突变型和野生型逆转录测序； 1d：例 3 母子 MCCC2 突变；1e：例 4 母女 MCCC1 突变 2.2.2 基因新变异分析 正常对照者 100 个等位基因中未检出 5 种新变异，排除多态性可能。 PCR-RFLP 分析：新变异 c.203CT 和 c.572TC 用 BstX、AlwN两 种内切酶进行酶切，结果提示 BstX将对照者及父亲酶切产生 136 bp、117 bp 两个片段，c.203CT 突变的等位基因由于不能被酶切而产生 1 个 253 bp 片段， 故携带此杂合突变的母子将酶切产生 253 bp、136 bp 和 117 bp 三个片段（图 2a） ；AlwN 将对照者酶切成 137bp、128 bp 两个片段，c.572TC 突变的等位 基因不能被酶切而产生 1 个 265 bp 片段，携带此杂合突变的母子经酶切产生 265 bp、137 bp 和 128 bp 三个片段，未获得父亲 DNA（图 2b） 。 图 2 PCR-RFLP 酶切图 2a：BstX对例 1 c.203CT 突变酶切；2b：AlwN对例 2 c.572TC 突变酶切；P：母亲患者；Z ：子 女；F：父亲； N：对照者 剪接突变 c.639+5GT 经逆转录 cDNA 反向测序，结果显示外显子 6 出 现 148 个碱基杂合缺失而引起剪接错误（图 1c） 。 不同物种氨基酸序列比对：2 种 MCCC1 错义突变 （c.203CT/p.A68V，c.572TC/p.L191P）及 1 种 MCCC2 错义突变 c.1406GT/p.R469L 经 6 个不同物种与人类基因相应位点氨基酸比对分析， MCCC1 第 68、191 位和 MCCC2 第 469 位均为高度保守氨基酸（图 3） 。 图 3 3 种新错义突变在不同物种中的氨基酸序列比对 PolyPhen-2、SIFT、UniProt 和 PDB 分析 3 种新型错义突变经 PolyPhen-2 评分 0.9 1，SIFT 评分均为 0，突变导致蛋白的侧链结构发生变化， 可能改变蛋白构象而致病：（1）c.203CT/p.A68V 突变位于生物素羧化作用部 位（蛋白质活性部位） ，突变导致 68 位丙氨酸变为缬氨酸，侧链结构改变并与 73 位缬氨酸主链形成新氢键，氨基酸残基较野生型增大（图 4a） ；（2） c.572TC/p.L191P 突变位于 ATP 结合和生物素羧化作用部位（蛋白质活性部位） 且位于肽链 -螺旋结构区，突变导致 191 位亮氨酸变为脯氨酸，侧链结构改变 并与 187 位丝氨酸主链形成新氢键，氨基酸残基较野生型减小（图 4b） ；（3） c.1406GT/p.R469L 突变位于羧基转移酶部位，突变导致 469 位精氨酸变成亮 氨酸，侧链结构改变与 468 位丙氨酸主链间氢键消失，氨基酸残基较野生型减 小且具有更强的疏水性，电荷显中性（野生型带正电） （图 4c） 。 图 4 蛋白质二级结构图 红色：突变位点氨基酸主链；粉色：侧链；绿色虚线：氢键；粉色虚线：突变产生的新氢键； 4a：c.203CT/p.A68V 野生型和突变型；4b：c.572TC/p.L191P 野生型和突变型；4c：c.1406GT/p.R469L 野生型和突变型 3 讨论 MCCD 的临床表型差异较大，又分为有症状型，无症状型和母源型 3 种。 严重者在新生儿期表现为喂养困难、阵发性呕吐、腹泻，抽搐、嗜睡、昏迷、 呼吸暂停、生长发育迟缓、肌张力异常等；临床以无症状型多见 2-4；母源型较 少，即母亲为 MCCD，因其增高的 C5-OH 通过母乳或胎盘传输给新生儿 8，导 致新生儿筛查时血 C5-OH 增高，对父母检测后才发现母亲是 MCCD 患者。有 些母亲患者在禁食或高蛋白质饮食下、尤其在孕期可出现肌病、肝酶增高、脂 肪肝和易疲劳等症状。Gibson 等 9率先报道了 4 例 MCCD 母患共 14 次孕期及 分娩史，其中仅 1 例曾出现上诉症状。Koeberl 等 10报道 4 例 MCCD 母患，除 1 例曾在高蛋白饮食后出现呕吐外，其余均无症状。母源性 MCCD 新生儿通常 生后筛查时血 C5-OH 浓度不同程度增高，随访一段时间可恢复正常 9-11。本文 在国内首次报道了 5 例母源性 MCCD，母亲为良性 MCCD，受影响的新生儿出 生 3 天血 C5-OH 不同程度增高，随访后逐步下降或达正常（最长随访至 3 岁） ， 均无症状，生长及智能发育正常，诊断为母源性 MCCD（暂时性） 。因此，对 新生儿筛查发现血 C5-OH 增高者，需常规对其母亲检测以诊断母源性 MCCD。 MCCD 与下列 4 种 C5-OH 增高疾病的鉴别主要依靠尿 GC/MS。 （1）多种 酰基辅酶 A 羧化酶缺乏症：除尿 3-HIVA 及 3-MCG 增高外，3-羟基丙酸、甲基 枸橼酸、甲基巴豆酰甘氨酸及酮体增高 12；（2）3-羟-3-甲基戊二酰辅酶 A 裂 解酶缺乏症：尿特异性 3-羟-3-甲基戊二酸增高；（3）3-甲基戊二酰辅酶 A 水 解酶缺乏症：3-甲基戊烯二酸、3-甲基戊二酸增高；（4）-酮硫解酶缺乏症： 大量酮尿及 2-甲基-3-羟基丁酸增高。我们报告的 MCCD 母亲患者及其子女的 血、尿质谱分析均排除了上述其他 4 种有机酸代谢病。 无临床症状的 MCCD 患者无需治疗。对于有症状者可给予限制亮氨酸、蛋 白质饮食，而甘氨酸或生物素治疗通常无效；对于伴游离肉碱缺乏者需要补充 左旋肉碱；急性发作期患者应给予葡萄糖、纠酸、维持电解质平衡等治疗 13。 MCCC1 和 MCCC2 基因突变均可导致 MCCD。MCCC1 定位 3q25-27 区， 包含 19 个外显子，长度为 2580 bp，编码 725 个氨基酸多肽。MCCC2 定位 5q12-q13.1 区，包含 17 个外显子，长度为 2304 bp，编码 563 个氨基酸多肽。 MCCC1 包含共价连接生物素的辅基及碳酸氢盐和 ATP 的结合位点，MCCC2 则包含酰基辅酶 A 酶作用物的结合位点即主要结合甲基巴豆酰辅酶 A3。目前 已报道 MCCC1 和 MCCC2 基因突变各 60 余种 14-16，c.1155AC（p.R385S）为 较常见的热点突变。2012 年韩国首次报道 c.838GT（p.D280Y）为其热点突变， 日本于 2007 年也报道 1 例携带此突变 17。本研究发现 3 例母亲携带 2 个基因 突变，1 例仅找到 1 个杂合突变，可能因另一突变隐藏于非编码区无法经 PCR 直接测序检出或其他不确定因素造成；新生儿均携带来自母亲的 1 个杂合突变， 为杂合子。MCCC1 突变为 MCCD 患者较常见的突变。已报道突变 c.592CT/p.Q198X 见于 1 例无症状新生儿筛查发现的 MCCD 患者，该突变位 于羧基转移酶位点使 198 位谷氨酰胺变为终止密码子，影响了蛋白结构和功能 17。已发现的 5 种新变异均被证实可能对蛋白结构和功能产生影响： c.203CT/p.A68V 突变将产生新的氢键，氨基酸残基较野生型增大，可能无法 匹配蛋白质的核心区域而影响蛋白的活性；c.572TC/p.L191P 突变也产生新的 氢键，氨基酸残基较野生型减小，可能引起蛋白核心区域空缺，且突变后脯氨 酸破坏 -螺旋结构，对蛋白质结构造成严重影响；c.1406GT/p.R469L 突变引 起氢键消失，氨基酸残基较野生型减小，疏水性增强，电性改变可能造成和其 他分子相互作用消失；c.ins1680A 引起突变位点后第 9 个氨基酸提前出现 TAA 终止密码子造成蛋白结构改变；剪切突变 c.639+5GT 使外显子 6 杂合缺失引 起剪切错误，造成蛋白结构改变。因此，上述 5 种未报道的变异很可能是致病 新突变，需进一步体外蛋白功能表达研究验证。 已有的研究提示 MCCD 表型和基因型间无明确的相关性，调控基因和环境 因素等也可能影响表型。例如，较常见的 MCCC1 突变 p.R385S 可导致严重的 临床表型，但也可无症状，故难以通过基因型预测临床表型 3,11。因本研究病 例较少，临床无症状，难以分析基因型和表型的关联性，尚需累积更多的病例 进行分析。 参考文献 1 Eldjarn L, Jellum E, Stokke O, et al. -Hydroxyisovaleric aciduria and - methylcrotonylglycinuia:a new inborn error of metabolism. 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