寄生虫感染实验室检验-廖天利 microsoft word 文档

西 南 大 学 研 究 生 课 程 考 试 答 卷 纸 考 试 科 目 现 代 兽 医 诊 断 学 院 、 所 、 中 心 动 物 科 技 学 院 专 业 或 专 业 领 域 兽 医 专 业 硕 士 研 究 方 向 临 床 兽 医 级 别 2 0 0 9 学 年 2010 年 学 期 第 一 学 期 姓 名 廖 天 利 学 号 122009328050008 类 别 兽 医 硕 士 （全 日 制 博 士 全 日 制 硕 士 教 育 硕 士 高 师 硕 士 工 程 硕 士 农 推 硕 士 兽 医 硕 士 进 修 ) 2010 年 11 月 05 日 研 究 生 院 (筹 )制 课 程 类 别 必修课 课程考试方式 课程论文 题号 得分 教 师 评 价 一 二 三 四 五 六 七 八 九 十 总分 任课教师签名： 备注：成 绩 评 定 以 百 分 制 或 等 级 制 评 分 ， 每 份 试 卷 均 应 标 明 课 程 类 别 （ 必 修 课 选 修 课 同 等 学 力 补 修 课 ） 与 考 核 方 式 （ 闭 卷 笔 试 口 试 开 卷 笔 试 课 程 论 文 ） 。 课 程 论 文 应 给 出 评 语。 文献综述 寄生虫感染实验室检验 摘要：寄生虫病目前仍是人畜共患的重要疾病。但近年来，人们逐渐忽略了对寄生虫的检测， 近期我国发生了一系列由寄生虫感染造成的公共安全事件，甚至造成严重的后果， 让人们又 重新去审视这类人畜共患疾病。本文 对寄生虫的主要实验 室检验技术进行了综述。 关键词：寄生虫；感染；实验室检验 寄生虫是一病原生物体，如单细胞生物(原虫)或蠕虫等，它们通常寄生于 比其大得多的生物体(宿主)内。寄生虫病目前仍是人畜共患的重要疾病，但随 做环境卫生的不断改善，寄生虫病例的减少，人们逐渐忽略了对寄生虫病的关 注，对寄生虫的检测也相应减少。近年来，北京的“食用福寿螺感染寄生虫” 事件、广东的肝吸虫感染事件等一系列严重危害公共安全的寄生虫病感染，让 人们再一次引起对寄生虫病的高度关注。本文对寄生虫的主要实验室检验技术 进行了综述。 1 寄生虫感染实验室诊断 检验临床标本中的病原体，诊断寄生虫感染，通常采用最多的是形态学标 准，而不是用生化手段、培养及虫体生长特性。最终的寄生虫鉴定经常依靠浓 集和( 或 )染色标本的显微 镜分析，通常在油镜下(l000)观察，在一定程度上依 赖于显微镜观察者的技术，原虫体积很小，有些是细胞内寄生的，需要大量分 离和染色才能鉴定。蠕虫感染一般通过在各种临床标本、主要是肠道样本中发 现虫卵、幼虫和( 或) 成虫予以诊断。 11 病原检查 在寄生虫感染中，检查出寄生虫病原体是确诊的依据。根据临床诊断提供 的线索，通过标本的采集、处理、检验、分析等，做出明确结论，为临床治疗 和流行病学调查提供可靠的依据。根据寄生虫的种类、在人体的发育阶段和寄 生部位的不同可采集相应的标本(粪便、血液、阴道分泌物、尿液、痰液、组织 活检或骨髓穿刺等)，采取不同的检查方法。对于肉眼可见的大部分蠕虫和节肢 动物，根据其标本来源和形态特征可作出初步判断，如粪便中的蛔虫、蛲虫、 绦虫节片、组织中的蝇蛆等；对于原虫等肉眼无法见到的小型寄生虫，如阿米 巴原虫、阴道毛滴虫、疟原虫、各种蠕虫的卵、疥螨、蠕形螨等则须借助显微 镜观察 1。病原体检查的质量取决于检验医生的责任感和对寄生虫的形态、生 活史、致病等基本知识和基本技能的掌握程度。 12 免疫学检查 有些寄生虫病难以根据症状或体征及病原检查作出诊断，此时需采取免疫 学方法辅助诊断。在感染早期、轻度感染、单性感染(仅有雄虫)、隐性感染或 由于特殊的寄生部位而使病原检查十分困难以及在流行病学研究中，免疫诊断 具有突出的优点。所用的抗原包括同种抗原、生活史某期特异性抗原或基因工 程抗原。根据反应原理分为皮内反应和血清学试验(沉淀反应，凝集反应和标反 应)。检测物质包括特异性抗体、循环抗原、免疫复合物。近年来也有学者检测 细胞因子以了解机体的免疫状态、抗虫感染的免疫机制或作为疗效评价的参考。 此外，嗜酸性粒细胞计数和嗜碱性粒细胞脱颗粒试验也可用于蠕虫感染的辅助 诊断。近年发展起来的蛋白质芯片技术可望为寄生虫感染的免疫诊断带来又一 技术突破。 13 分子诊断 检测的靶物质为寄生虫基因组中特异性的 DNA 片段。例如根据碱基互补 原理可设计并标记 DNA 探针(probe)进行原位杂交 (insitu hybridization)；也可设 计合成引物进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR) ，扩增样本中微 量的 DNA 片段。将免疫检测技术与基因扩增技术嫁接而创立的 PCR ELISA，用于疟原虫的检测，最低可测阈值为 0001的原虫密度本世纪之 交发展起来的 DNA 微阵I(DNA microarray)，或称 DNA 芯片(DNAchips) 技术 通过高通量、自动化的 DNA 杂交检测，可在一张芯片上同时检测成千上万个 DNA 片段，将为包括寄生虫病在内的感染性疾病和遗传性疾病的基因诊断带来 一场革命。理论上，检测某种寄生虫的特异性 DNA 片段与检测虫体具有同样 的诊断价值 2。 2 粪便寄生虫感染检验方法 21 直接涂片法(direct smear method) 目的是确定某些原虫和蠕虫感染的可能性、估计病人的虫负荷、观察虫体 的运动。任何没有冷冻的、在特定时间内送到实验室的新鲜粪便标本都可以接 收并检验。送到实验室的防腐保存的粪便标本在浓集和永久染色涂片之前不必 要做直接涂片检查 3。 常用方法有生理盐水涂片法和碘液染色涂片法，前者适用于检查各类原虫 的滋养体和蠕虫卵，后者适用于检查原虫的包囊。为获得较准确的结果，每份 粪便应做 3 张涂片此法简便快速，但粪便用量少，易于漏诊。由于仅用生理盐 水直接涂片法来证实虫体比较困难，因此，当有足够的样本以供永久性染色涂 片时，才采用本技术。 用直接涂片法，在低倍镜下(放大 100 倍)要查看全部盖片，高倍镜下(放大 400 倍) 至少要查看盖片的 l3，如无虫体，才能确定结果为阴性。 211 检查蠕虫卵 用生理盐水直接涂片法。于载玻片近中央处滴加生理盐水 12 滴，用牙签 挑取粪便少 许，放于生理盐水中搅匀后摊开，涂成均匀的薄粪膜，覆以盖片， 置镜下检查。生理盐水的滴加量视粪便的稠、稀而定，粪膜厚薄以透过粪膜赂 能辨认其下面报纸的字迹为度 4。虫卵的辨认依据形状、大小、颜色、卵壳及 卯盖、内含物等特征，并注意与粪便残渣和食人的酵母菌真菌、花粉、植物纤 维、油滴等异物加以区别 5。 212 检查原虫 (1)活滋养体检查：方法同蠕虫卵的检查，但粪便必需新鲜，以豹液血便虫 体较多，涂片要薄而均匀。虫体适应涂片处理需要几分钟时间，几分钟内，虫 体的运动不明显，然后，可以看到滋养体伪足移动、鞭毛挥动，运动渐趋活泼， 无色。由于可能存在上皮细胞、巨噬细胞、多形核白细胞和红细胞，需要仔细 检查以寻找阿米巴。滋养体的活动与环境温度有关，气温较低时，须将载片和 生理盐水略加温后再涂片，最好在装有保温台保持恒温的显微镜下观察 6。 (2)检查包囊：以碘液代替生理盐水滴加于载玻片上，挑取米粒大小的粪便 置于碘液中，调匀涂片，加盖玻片 7。也可先制备生理盐水涂片，加盖玻片， 然后在盖玻片一例边缘加 l 滴碘液，使其渗人生理盐水涂片。这样，一侧粪膜 染成浅黄色，另一侧仍保持原色，既便于比较，又可同时检查包囊和滋养体。 碘液涂片中，溶组织内阿米巴包囊呈黄色或黄绿色，糖原泡呈棕红色，囊 壁、核仁和拟染色体均透明无色。蓝氏贾第鞭毛虫包裹，椭圆形，二核或四核 常在一端，鞭毛卷曲发亮。迈氏盾鞭毛虫，包囊柠檬形，一核，一胞口。等胞 球虫卯囊椭 圆形，成熟卵囊内含孢子囊 2 个，每个孢子囊各含 4 个子孢子，一 个残国体，无囊塞(stiedabody)。 碘液配制：碘化钾 48g，溶于 100mL 蒸馏水中，再加入碘 28g，溶解后贮 于棕色瓶中备用 8。 22 厚涂片透明法(加藤法 Katos method) 该方法适用于检查蠕虫卵。将 l00 目时的尼龙或金属网 (大小约 4cm x 4cm)覆盖在粪便标本上，用刮棒自网上刮取挤送到网面上的粪便约 50m8，置于 载玻片上。用浸透甘孔雀绿溶液的亲水玻璃纸条覆盖在粪条上，上面用橡皮 塞轻压，使粪膜铺开成 20mm25mm 大小长椭圆形，置 3O36 温箱中，约 30min 粪膜透明后镜检。如在 24毫温中 U 需 l 15h。掌握粪膜厚度和透明 时间对于虫卵的辨认非常重要，钩虫卵不宜透明过久。 玻璃纸的制备：将玻璃纸剪成大小约 22ram30mm 的小片，浸泡于甘油孔 雀绿液(3 孔雀绿 lml，甘油 100mL，水 l00ml)中 24h 以上，使玻璃纸浸透呈绿 色即可使用 9。 23 定量透明法(Kato-Katz 虫卵计数法) 此法即改良加藤法(modified Kat。 sthick smear)，适用于各种粪便内蠕虫卵 的检查及计数。通过计数虫卵，估测虫负荷，对确定感染密度、指导化学疗法、 评估疗效有一定参考作用。 此法系应用改良聚苯乙烯作定量板，大小为 40ram30mm X 137mm，模 孔为一长圆孔，大小为 8nmi4mm，两端呈半圆形，所取的粪样平均为 417rag。操作时将大小约 4cm 4cm 的 100 目尼龙网或金属筛网覆盖在粪便标 本上，自筛网上用刮片刮取粪便，置定量板与载玻片上，用左手的两指压住定 量板的两端，将刮片上的粪便填满模孔，刮去多余粪便。掀起定量板，载玻片 上留下一个条形粪样，然后在粪条上覆盖含甘油一孔雀绿溶液的大小约为 5025cm 的玻璃纸条，展乎后加压，使玻璃纸下的粪便铺成长椭圆形；经 l2h 粪便透明后置镜下计数。将所得虫卵数24，再乘上述粪便性状系数，即 为每克粪便虫卵数(e88s per 8ram，EPG)常见蛹虫每条雌虫每天排卵数 10。 3 结语 近年来国内外发展起来的高新技术方法，如单克隆抗体技术(McAb)、免疫 印渍技术、DNA 探针技术和基因扩增技术等，为寄生虫病的诊断或寄生虫虫种 分类提供新的途径，有广泛应用前景。 参考文献： 1许炽螵寄生虫病实验诊断的进展J 中华检验医学杂志， 2006(7) 2叶彬，陈雅棠寄生虫病实验室诊断研究进展J 中国实用内科杂志， 2002(1) 3寄生虫病J中国医学文摘 儿科学，2004(6) 4孙惠珍，常正山，邱持平，等从寄生虫病咨询看加强健