山仙颗粒对气虚血瘀证肝癌侵袭转移相关因子影响的实验研究

肝癌气虚血瘀证与侵袭转移相关因子关系 的实验研究 李仁廷 张晓炜 (陕西中医学院附属医院，陕西咸阳 712000) 摘要 ：目的：观察山仙颗粒对肝癌气虚血瘀证模型动物侵袭转移相关因子(MVD、VEGF)表 达的影响。方法：将 60 只雄性 ICR 小鼠随机分成 4 组：15 只为空白对照组(A 组)，气虚血 瘀造模，另 45 只为实验组，全部进行肿瘤造模及气虚血瘀造模，每组 15 只，分别为：肿 瘤模型组（B 组） ，山仙颗粒组(C 组)，羟基喜树碱组(D 组)。观察山仙颗粒对各组小鼠 VEGF、MVD 表达的影响。结果：山仙颗粒组(C 组) VEGF、MVD 的表达显著低于肿瘤模型组 (B 组)及对照药物羟基喜树碱组(D 组)。结论：山仙颗粒具有抗气虚血瘀证肝癌侵袭、转移 的作用。 关键词：肝癌，山仙颗粒，气虚血瘀，益气活血，中医药疗法 原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤,具有起病隐匿、进展迅速、生存期短、侵袭转移性 强、预后差等特点。临床上疗效不理想，即使早期切除，术后 5 年复发率仍高达 60%以上 (小肝癌为 40% 50% ) 1，其根源就在于肿瘤早期即发生侵袭和转移。近年开展肝癌的 局部治疗：如肝动脉化疗并栓塞、射频等，其转移复发率比切除还要高；即使作肝移植， 癌转移复发仍然是首要问题 2。因此开展抗肝癌侵袭转移的研究在肝癌的防治方面具有极 其重要的意义。 本实验旨在通过对 H22肝癌瘤株转染的气虚血瘀型 ICR 小鼠各造模组治疗方法间的 VEGF、MVD 表达进行比较，探讨山仙颗粒抗肝癌气虚血瘀证侵袭转移的作用,从而为临床采 用益气活血法治疗肝癌侵袭转移提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 实验动物及瘤株 瘤株：H 22小鼠肝癌瘤株荷瘤小鼠（陕西省中医药研究院试验动物中心提供） 。 实验动物：ICR 健康雄性小鼠 60 只，16-18 月龄,体重约 25-30 克（由陕西省中医药研 究院实验动物中心提供 合格证号：医动字第 02-24 号） 。 1.2 实验药品及试剂 1.2.1 药品 1) 山仙颗粒（由陕中附院制剂中心提供，生产日期：20051104；每 10 克相当于原生 药 11.5 克） ，按小鼠 5g/kg（相当于临床用量）配制成比例为山仙颗粒：生理盐水为 1：2（0.5g/ ml）的药液。 2) 羟基喜树碱（2mg/ml）：长春天诚药业有限公司生产,批号:990702，临用以生理盐 水配制浓度为 0.01mg/ ml 的药液。 1.2.2 试剂 VEGF 多克隆抗体（北京博奥生物技术有限公司，兔抗人 IgG：Vegf：产品编号:bs- 0297R） 。 CD34 多克隆抗体（北京博奥生物技术有限公司，兔抗小鼠 IgG1：CD34 产品编号：bs- 0204R） 。 S-P 免疫组化染色试剂盒（兔 sp 检测试剂盒:北京中杉金桥生物技术有限公司，生产 批号：512821CB） ；DAB 显色剂（北京中杉金桥生物技术有限公司，生产批号：50681680） 。 1.3 主要仪器 光学显微镜、倒置显微镜、电子天平、超净工作台、200 目筛网、离心机、组织研磨 器、冰箱、微量移液器、恒温水浴箱。 1.4 实验方法 1.4.1 肿瘤模型的建立 参照文献方法，每只小鼠右腋皮下接种浓度为 1107/ml 的肝癌 H22瘤细胞悬液 0.2ml。 1.4.2 动物分组 将 60 只雄性 ICR 小鼠随机分成 4 组，每组 15 只，分别为：空白对照组(A 组)，气虚 血瘀造模，肿瘤模型组(B 组)，山仙颗粒组(C 组)，羟基喜树碱组(D 组)，后 3 组全部进行 肿瘤造模及气虚血瘀造模。 1.4.3 气虚血瘀模型的建立 参照王键等 3报道的多因素复合造模方法及评价方法进行，于接种瘤细胞悬液第 2 天 开始建立气虚血瘀模型。 1.4.4 给药 于接种瘤细胞悬液次日起给药，A、B 组每日用生理盐水灌胃 0.2ml/只/d，共 21d；C 组用山仙颗粒药液 0.2ml/只/d 灌胃，共 21 天；D 组用羟基喜树碱溶液 0.5ml/只/d 腹腔注 射，连用 3 天。 1.4.5 观察项目及方法 1.4.5.1 观察一般情况及体重 包括小鼠饮食、活动情况，精神状态，对刺激的反应，毛色变化，有无腹泻、消瘦及 死亡，出瘤时间以及肿瘤节结的大小，并做好记录。 1.4.5.2 明确气虚血瘀模型是否建立成功 参照文献 3方法进行评价。 1.4.5.3 观察实验指标 小鼠处死后取出腋下瘤体，常规固定、石蜡包埋、连续切片，采用 SP 法测定 VEGF 的 表达和 MVD。MVD 计数：对 CD34 染色的肿瘤微血管参照文献 4方法进行，先在低倍镜(100 倍)下全面观察切片选定残癌组织内血管密度最高处( 即“热点“)，然后在 400 倍镜下取 3 个 视野分别计算所有染色的微血管，取 3 个测定值的平均数为 MVD 值。VEGF 阳性结果判定:采 用半定量计分方法，染色强度计分为：不染色=0，轻度染色(淡黄) (+)=1，中度染色(棕黄) (+)=2，强染色 (深棕黄) (+)=3。染色比例计分为：无细胞染色 =0，小于 25%细胞染色 =1， 25%50%细胞染色=2，大于 50%细胞染色=3，若两种计分之和小 于 2 为阴性，24 为阳性，大于或等于 4 为强阳性。 1.4.5.4 统计学处理 试验数据均以样本均数(xs)表示，采用两独立样本间 t 检验和 Radit 分析及 x2检验， 并使用 SPSS 11.0 统计软件，P0.05 或 P0.01 为有统计学意义。 2.结果 2.1 一般情况及体重 实验全过程中共有 4 只小鼠死亡，分别是：肿瘤模型组(B 组)2 只，山仙颗粒组(C 组) 1 只，羟基喜树碱组(D 组)1 只。实验组小鼠接种肝癌细胞悬液后，约 7-10 天后，小鼠右 腋下出现肿瘤，部分小鼠甚至出现皮下结节。气虚血瘀模型造模后实验组小鼠均出现精神 萎顿、眼睛发红、毛发稀疏无光泽、大便稀溏、体重减轻、舌质暗淡、尾巴青紫等征象。 给药后山仙颗粒组(C 组)小鼠气虚血瘀模型评分基本维持不变，肿瘤模型组(B 组)及羟基喜 树碱组(D 组)小鼠气虚血瘀模型评分均明显增高。实验开始时各组平均体重无显著性差异 （P0.05 ） ；实验结束时，未用药的气虚血瘀肝癌组（B 组）小鼠体重明显较其他组小鼠轻， 有显著性差异（P AB 0.05)。 2.3 各组小鼠 VEGF 指标测定的比较(见表 1) 表 1 各组小鼠 VEGF 表达情况 组别 例数 - + + + A 组 15 15 0 0 0 B 组 13 2 3 4 4 D 组 14 6 4 3 1 C 组 14 5 4 3 2 表 1 显示：未用药小鼠 B 组 VEGF 表达明显较其他组高，有显著性差异（P AB0.05） 。 2.4 各组小鼠 MVD 值测定的比较(见表 2) 表 2 各组小鼠 MVD 值测定 组别 例数 MVD A 组 15 B 组 13 40.547.52 D 组 14 23.075.35 C 组 14 29.424.78 表 2 显示：实验组小鼠未服药 B 组 MVD 表达明显较其他组高，有显著性差异（P CB0.01，P DB0.01） 。山仙颗粒组 C 组较羟基喜树碱 D 组 MVD 表达均略低，有显著性 差异（P CD 0.01） 。 3.讨论 肿瘤微血管形成是实体瘤生长、浸润、转移及复发的前提 56，没有血管新生和血液 供应的肿瘤是不能持续生长的，而一旦肿瘤形成自己的血管系统就会呈指数生长并侵犯血 管、淋巴而发生转移。肿瘤的转移、子瘤的生长过程与微血管形成密切相关。近年来，国 内外学者对乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌及非小细胞肺癌等多种肿瘤进行微血管密 度(microvessel density，MVD)的研究，进一步证实， MVD 可作为肿瘤转移的预测因子， 是一个独立而重要的预后因素，高 MVD 提示容易发生转移，预后不良 67。在肿瘤血管生 成的评估中，肿瘤微血管密度是衡量肿瘤血管形成的标志，观察肿瘤治疗药的抗肿瘤血管 形成作用的常用指标。新生血管的不断形成是肿瘤生长、浸润、转移的必要条件，而肿瘤 血管生成的启动是由许多促血管生长因子所诱导的，这些主要由肿瘤细胞所分泌的血管生 长因子，直接或间接地作用于血管内皮细胞，促进血管形成，而血管内皮生长因子 (vascular endothel ial growth factor，VEGF)是目前所知作用最强、特异性最高的促血 管内皮增殖的细胞调控因子，在多种肿瘤中均有高表达，是一个最具普遍意义的肿瘤微血 管生成刺激因子，其表达与 MVD 呈正相关 8。在评价药物抗肿瘤侵袭转移作用方面，VEGF 是最有说服力的指标。 本研究结果表明: 山仙颗粒组(C 组)小鼠一般状况优于对照药物羟基喜树碱组(D 组)及 未治疗组， VEGF 的表达及 MVD 上均显著低于对照药物羟基喜树碱组(D 组)及未治疗组。山 仙颗粒通过降低促血管生成因子 VEGF 和 MVD，抑制肿瘤新生血管的形成，控制肿瘤侵袭转 移的恶性演进，发挥其抗肿瘤、抗转移作用。山仙颗粒是以益气活血为治疗大法的纯中药 治剂，本研究结果也从一个侧面论证了气虚血瘀在肝癌侵袭转移中的重要性，气虚血瘀是 肝癌发生侵袭与转移的重要机制，在预防肝癌侵袭转移的过程中，采用益气活血的治疗方 法尤为重要。 参考文献: 1Tang ZY, Ye SL, Liu YK, etal. A decades studies on metas-tasis of he patocellular carcinoma.J Cancer Res Clin Oncol,2004,130:187. 2汤钊猷.开展肝癌转移复发研究的意义与途径J.中华普通外科杂志.2006,12(11):39. 3王键，赵辉，李净等，多因素复合制作气虚血瘀证脑缺血动物模型的实验研究J.中国 实验动物学报，2001，9 216220. 4Weidner N. Intratumor microvessel density as prognostic factor in cancerJ. Am J Pathol ,1995 ,147 :9 -19. 51.Folkman J.The role of angiogenesis in tumor growthJ.Semin Cancer Boil.1992;3(2):65-71. 6Maed K，Chung YS，Takatauka S，et al.Tumor angiogenesis asa predictr of Recurrence in gastric carcinomaJClin Oncol，1995;13(2)477-481. 7Zolota V，Oerokosta A，Melachrinou M，et al. Microvessel density，Proliferating activity，P53 and bcl-2 expression in situduetal