志贺氏菌的检测

志贺菌检测技术 摘要：志贺氏菌是引起人类肠道疾病常见的病原菌，在我国感染性腹泻病原菌中高 居首位。为了能够有效地预防、治疗和控制水或食源性传染病，对水或食品中志贺氏菌 的快速检测与鉴定显得十分重要。本文主要介绍了志贺氏菌的各项检测技术及其优缺点， 并对志贺氏菌的检验技术进行了展望。 关键词 : 志贺氏菌；检测技术；展望 前言：志贺菌是引起食源性疾病的常见病原。人体在感染后都可能出现恶心、呕吐、 腹痛等症状,对于症状不典型者,极容易被误诊为沙门菌、致泻性大肠埃希氏菌或霍乱弧 菌感染,影响治疗而导致慢性感染或带菌者,这一方面延误了患者的早期治疗,另一方面扩 大了病原体的传播。因此,迫切需要对病因进行准确而快速的诊断。目前,包括我国在内 的许多国家对这类致病菌的检验,大多仍沿用传统的细菌培养及鉴定方法,步骤繁琐,检验 周期长,远不能满足应对突发公共卫生事件上,及时诊断、结果准确、敏感性和特异性高 的要求。 正文 志贺氏菌是一类兼性厌氧、不产生芽孢的革兰氏阴性杆菌。长约23m、宽 0.50.7m、杆状或短杆状，不形成荚膜，无鞭毛，多数有菌毛；营养要求不高，能在 普通培养基上生长；最适生长温度为37，最适 pH 值为 6.47.8。志贺氏菌可分解葡 萄糖，产酸不产气。VP 实验阴性，不分解尿素，不形成硫化氢，不能利用柠檬酸盐或丙 二酸盐作为唯一碳源。 志贺氏菌属细菌的抗原由菌体抗原(O)及表面抗原(K)组成。O 抗原可分为群特异性抗 原和型特异性抗原，型特异性抗原可用于区别菌型。K 抗原可以阻止 O 抗原与相应抗血 清的凝集反应 3。根据生化反应和 O 抗原结构的不同，志贺氏菌可以分为痢疾志贺氏菌、 福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌。在发展中国家，由福氏志贺氏菌引起 的感染性腹泻疾病高居首位。 随着生物实验技术的发展，志贺氏菌的检测和鉴定技术也在不断的完善，大致可分 为三大类：常规生化鉴定方法、免疫学方法以及分子生物学方法。其中最为常用的是分 子生物学上的常规PCR检测。 常规生化鉴定方法 常规生化检测须经过增殖培养、分离纯化、生化试验、血清学实验等，检验步骤繁 琐、耗时长、准确性低，且一次检测完成样品项数较少 5，不能应对市场需求的快速准 确检验方法的要求。但这种方法具有直观、准确、稳定性好且假阳性率低等特点，因此 一直被沿用至今。国家标准方法 6中采用常规生化鉴定方法对志贺氏菌进行检测，整个 过程需要 45d。通过对 SS 培养基、Mac 培养基、HE 培养基和 MT 培养基进行比较，发 现 SS 培养基对志贺氏菌的检出率最高。为防止漏检其他菌型，可同时采用 Mac 培养基 来提高检出率。 免疫学方法 免疫学的发展为致病菌的快速检测提供了新方法，同时大大提高了致病菌检测的灵 敏性和特异性。除了凝集实验、沉淀实验和补体实验等经典的免疫学检测方法，以免疫 学方法为基础建立起来的检测技术也已被应用于志贺氏菌的检测。 酶联免疫技术 酶联免疫技术 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 是以免疫学反应为 基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高 的实验技术。建立间接 ELISA 方法以检测检测志贺菌纯培养液，其检出限为 10510 6CFU/ml；建立双抗夹心 ELISA 方法检测含0.11CFU/ml 志贺氏菌的样品在增菌 13h 后可检出阳性反应，含 110CFU/ml志贺氏菌的样品在增菌11h 后可检出阳性；用间 接 Dot-ELISA 方法检测志贺氏菌的检出限可达10 6CFU/ml。E L ISA 法具有灵敏、特异、 简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点，适用于志贺氏菌的快速检测，但ELISA 方 法影响因素多，假阳性率高且不易确定，还需要其他方法辅助检测。 SPA协同凝集法 金黄色葡萄球菌A 蛋白 (Staphylococcal protein A，SPA)是某些金黄色葡萄球菌细 胞壁的一种表面蛋白，具有同人和多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合的能力。 SPA 协同凝集法是用已知标准血清吸附到含A 蛋白的金黄色葡萄球菌表面，使之成为吸 附抗体的载体，再以此去诊断相应未知抗原产生的肉眼可见的凝集颗粒。用含A 蛋白丰 富的金黄色葡萄球菌菌体与志贺氏菌抗血清在一定条件下混合致敏，让抗体结合到金黄 色葡萄球菌细胞壁的A 蛋白上制成SPA 诊断试剂，样品经增菌后即可用SPA 诊断试剂来 检验。SPA 协同凝集法在 2448h 内即可得到检测结果，且检出率高，可作为一种快速 灵敏的检验方法。由于SPA 能结合大量抗体，大大提高了灵敏性，缩短了检验周期。 分子生物学方法 以分子生物学为基础建立的众多检测技术以其敏感、快速、高特异等特点成为生物 3 技术革命的新产物,已经应用于食源性致病菌的检测。检测志贺氏菌的分子生物学技术主 要包括：聚合酶链反应、脉冲场凝胶电泳、基因芯片和探针技术等。 聚合酶链式反应 志贺氏菌的传统检测方法耗时长，操作繁琐，已不能满足食品安全控制的需要。分 子生物学尤其是 PCR技术的发展给志贺氏菌的快速检测提供了广阔的空间。在此主要介 绍用于志贺氏菌检测的常规 PCR 检测方法，实时荧光 PCR 检测方法和多重 PCR 检测方 法。 常规PCR检测 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是依据DNA 模板模仿体内的复 制过程，在体外适合的条件下，以单链DNA 为模板，以人工设计与合成的寡核苷酸为引 物，利用热稳定的DNA 聚合酶沿5 3方向掺入单核苷酸来特异性地扩增 DNA 片段 的技术。通过对已知序列DNA 进行扩增，以侵袭性质粒抗原(invasive plasmid)作为检 测志贺氏菌的目的基因来设计引物，建立 PCR 检测方法。PCR 检测志贺氏菌的目的基因 有ipaB. ipaC、 ipaD 和 ipaH，还包括 set1A.set1B、 ial和 virA等片段。现将有关文献中 报道的用于检测志贺氏菌的引物序列总结于表21。 表21检测志贺氏菌的引物序列 基于PCR 方法的复合技术 PCR-ELISA 只需要6.5h 即可检测出，当测试大量标本时 PCR-ELISA 所需时间比 PCR-琼脂糖凝胶电泳更短。环介导等温扩增法能有效地在2h内检测最低限细菌量中的 ipaH基因以检测志贺氏菌。基于PCR 结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术，利用志贺氏菌 特异基因序列分别设计特异性引物，复合PCR 扩增产物经DHPLC 技术进行快速检测，从 样品制备、增菌到结果报告可在2d 内(2628h)全部完成。该方法是一种具有高灵敏度、 低检测成本、高通量检测新技术。 脉冲场凝胶电泳 脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)又称脉冲式交变电场 电泳，是一种用于分离大分子量线状DNA 的电泳技术。通过限制性内切酶消化菌株DNA 来进行细菌分型鉴定，经PFGE 分离，比较染色体限制性内切图谱，经过不同图型间比对 来分析同一菌种亚型的不同菌株来源及其变异特点。PFGE 方法是一种非常有效的分子分 型技术，是目前进行志贺氏菌流行病学分析最常用的方法之一。采用多重荧光定量PCR技 术做基因诊断，并通过PFGE 的分型方法，达到理想的志贺氏菌分型效果。PFGE方法具有 分型能力强，重复性好等特点，能及时查明暴发流行的传染源从而有效控制疫情的蔓延， 在志贺氏菌的分子流行病学研究中具有重要作用。虽然这一技术检测成本低，但却存在 着反应产物后处理极易受到污染造成假阳性的缺点。 RAPD技术 随机扩增多态性 DNA 技术(random amplified polymorphicDNA，RAPD)是建立在 PCR 基础上的一种可对未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。利用 RAPD 技术 建立一套可对水或食品中志贺氏菌进行鉴定的方法，其结果显示，志贺氏菌 ipaH引物扩 增阳性的细菌经 RAPD 技术进行基因水平的分型，发现同种志贺氏菌株产生基本相同的 条带模式，不同种的菌株，甚至同一种菌的不同型间的条带模式存在一定差异。RAPD 技 术利用随机引物扩增未知序列DNA，它具有特异性强、操作简便、快速等特点，并且弥补 了标准PCR 方法只能应用于已知DNA 序列的不足，可用于水或食品中志贺氏菌的鉴定。 基因芯片 是利用细菌16S rRNA(或16S rDNA)基因作为检测的靶基因，设计针对不同菌属的寡 核苷酸探针制备基因芯片，通过杂交检测细菌的种类。基因芯片可以通过以下三种途径 应用于肠道致病菌的检测：直接检测致病菌的DNA或RNA；结合多重PCR 对致病菌的毒力 因子或者特异性基因进行鉴定；以致病菌核糖体RNA作为检测的靶基因同时检测多种肠道 致病菌。设计的基因芯片能够区分沙门菌属、志贺菌属、葡萄菌属和耶尔森菌，对于未 知菌落，利用基因芯片能在4h内完成细菌菌属的鉴定。李君文等利用基因芯片技术检测 水中常见致病菌获得较高的敏感性，可实现高通量、并行检测，一次实验即可得到全部 结果。用一个包括有8 种肠道致病菌中34 种毒力基因的肠道致病菌基因芯片，可以成功 地应用于腹泻患者粪便样品中病原菌的鉴定。由于基因芯片技术具有特异性强、敏感性 高，操作简便且高效快速等优点，该技术要优于其他分子生物学检测方法。基因芯片技 术在肠道致病菌检测中有着巨大的应用价值，具有广阔的应用前景。 基因探针技术 基因探针是从微生物中提取或扩增特异性的DNA片段，纯化后标记上可被检测的指示 剂如放射性同位素、荧光物质等，使之成为特异性DN 探针。用决定该微生物特有生理、 生化特性并与rRNA互补的rDNA序列来构建特异性的DNA 探针，检测细菌rRNA中的靶序列 可大大提高其敏感性。 结论 5 随着食品安全检测标准的提高，寻找更加快速、准确、便捷的检测技术显得至关重 要。志贺氏菌的检测方法很多，各具利弊。随着生物实验技术、免疫学技术以及分子生 物学技术的发展，志贺氏菌的检测和鉴定方法将得到不断地改进和完善，并朝着快速简 便、灵敏性高、特异性强且经济的方向发展。同时，还需建立、健全食品法规，加强食 品安全监控，提高检测技术，使我国相应的法规、标准与国际接轨，特别是使食品快速 检测技术达到国际先进水平。 参考文献 1 曾庆梅,张冬冬,杨毅,等.食品微生物安全检测技术J.食品科学,2007,28(10):632-637. 2 GB/T4789.5-2003食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验S. 3 葛萃萃,钟青萍.抗志贺氏菌IgY的提纯及建立间接ELISA检测志贺氏菌J.中国食品学报, 2006,6(1):11-14. 4 钟青萍,葛萃萃,张世伟,等.检测食品中志贺氏菌的双抗夹心ELISA方法的研究J.食品科技分析检 测,2007,32(10):199-202. 5 秦巧玲,郭爱玲.志贺氏菌多克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立D.武汉:华中农业大学,2008. 6 中华人民共和国国家标准食品微生物学检验.中国标准出版社,2004 7 金梅,魏东,周林.荧光分析在食品安全快速检测中的应用J .现代食品科技,2005(1): 25-28 8 张洁梅.食品微生物检验技术的研究进展J.现代食品科技,2005,21(2):221-222 9 中华人民共和国国务院200322.突发公共卫生时间应急条例. 10 牛天贵.食品微生物学实验技术M.中国农业大学出版社,2002. 11 李业鹏,钟凯,杨宝兰,等.食品中沙门菌 PCR 检测方法的建立J.中国食品卫生杂志,2006,18 (1): 17-22. 12 汪琦,张昕,张惠媛,等.利用 PCR 方法快速检测食品中的沙门氏菌J.检验检疫科学,2005,15 (6): 26-28. 13 李燕俊, 刘秀梅. 脉冲场凝胶电泳技术及其在致病菌研究中的应用J. 国外医学: 卫生学分册, 2005, 32(5): 305-309. 14 甘莉萍 , 刘渠, 陈应坚, 等. 荧光定