慢性乙肝患者血清h b v c c c d n a 检测的临床意义作者

慢性乙肝患者血清 H B V c c c D N A 检测的临床意义作者：编辑 时间：2013-01-29 10:42 点击：57 慢性乙肝患者血清 H B V c c c D N A 检测的临床意义 摘要：目的 探讨慢性乙肝患者血清 HBV cccDNA 与现有血清学指标 (AST、ALT、TBIL、HBeAg、HBV DNA)的相关性。方法 选取 309 医院 2009 年 5 月- 2012 年 5 月就诊的慢性乙肝患者 58 例，采用 Roche C6000 电化学发光法检测 HBeAg；日 立 Hi7600 全自动生化分析仪检测 ALT、AST、TBIL；采用实时荧光定量 PCR 检测血清 HBV DNA、HBV cccDNA 载量。结果 血清 HBV cccDNA 与 HBV DNA 有很好的相关性 (r=0.880，P=0.000) 。HBeAg 阳性组 HBV cccDNA 阳性的比例为 67.6%，显著高于 HBeAg 阴性组的 37.5%(2=5.170，P=0.023)。血清 HBV cccDNA 与肝 组织炎症的严重程度呈正相关(2=4.819 ，P=0.028)。结论 血清 HBV cccDNA 定量检测 是评价 HBV 复制情况和肝细胞损伤程度的较为可靠的指标。 关键词：慢性乙型肝炎；共价闭合环状 DNA；HBV DNA；乙肝 e 抗原；谷丙转氨酶 目前慢性乙肝的实验室检查常采用免疫学指标 HBeAg、HBV DNA 反映病毒复制情况， 其特 异性好但灵敏度相对较低；采用生化指标 ALT、AST、TBIL 反映肝细胞损伤程度，其灵 敏度好但特异性相对较差。共价闭合环状 DNA(cccDNA)是 HBV 基因组复制中间体 mRNA 和前基因组 RNA 的模板，可长期存在于细胞核中，是 HBV 持续染的关键，也是乙肝慢性 化的主要原因1-2。当肝细胞变性坏死时，肝细胞核内的 cccDNA 可释放入血。有研究表 明血清 cccDNA 与肝内 cccDNA 有非常好的相关性3 ，且血清 cccDNA 可反映肝细胞损伤 的严重程度。本文通过对 58 例慢性乙型肝炎患者血清 HBV cccDNA 与现有血清学指标的 相关性分析，探讨其在慢性乙肝患者病毒复制和肝细胞损伤评价中的意义。 材料和方法 1 标本采集及保存 标本来自 309 医院 2009 年 5 月-2012 年 5 月 58 例门诊和住院慢性 乙肝患者，其中男 48 例，女 10 例。年龄 18-80 岁，平均 46.25 岁。诊断符合 2010 年修订 的慢性乙型肝炎防治指南 4，排除甲、丙、丁、戊型肝炎和其他原因所致的肝损害。 依据肝组织切片的病理组织学结果将肝组织炎症分为轻度(G1-2)、中度至重度(G3-4)。诊断 标准见病毒性肝炎防治方案5。抽取患者空腹静脉血 5ml，待完全凝固后 3 000r/min 离心 10min，分离血清置-80冰箱保存。 2 主要仪器与试剂 1) 仪器：德国艾本德股份公司 (Eppendorf)的 Mastercycler ep realplex 实时荧光子生物学检验。定量 PCR 仪，罗氏公司的 C6000 免疫分析仪，日立 Hi7600 全自 动生化分析仪。2)试剂：北京索奥生物医药科技有限公司的乙型肝炎病毒 cccDNA 核酸扩 增检测试剂盒检测 HBV cccDNA；上海复兴公司的乙肝病毒核酸定量检测试剂盒(PCR荧 光探 针法)检测 HBV DNA；上海罗氏诊断产品有限公司的乙型肝炎病毒 HBeAg 检测试剂盒( 电 化学发光法)检测 HBeAg；北京莱帮生物技术有限公司测定试剂盒检测 AST、ALT 、TBIL。 3 HBV cccDNA 的试剂准备 从试剂盒中取出 HBV-cPCR MIX、Taq 酶系，室温融化并 振荡混匀。按样本数(血清标本 +阴性对照+阳性对照+标准品)N 取 HBV cccDNA PCR 反应 液 n24l、Taq 酶 n2l，充分混匀，10 000r/min 离心 10s。按每管 26l 加入 0.2ml 离心反应管中。 4 HBV DNA 的试剂准备 从试剂盒中取出 HBV-PCR 缓冲液、Taq 酶系、荧光探针、 MgCl2。室温融化并振荡混匀 10s。按样本数(血清标本+阴性对照+阳性对照+标准品)N 取 HBV PCR 反应液 n18l、 Taq 酶 n2l、荧光探针 n3l 、MgCl2 n3l，充分 混匀，10 000r/min 离心 10s。按每管 26l 加入 0.2ml 离心反应管中。 5 模板的提取 取 50l 待检血清标本( 冻存血清使用前在室温融解，并充分混匀)分别加 入 50l 核酸提取液 A，振荡混匀 10s，13 000r/min 离心 10min。弃去上清 95l，分别加 50l 核酸提取液 B 至沉淀中，振荡混匀 10s，100恒温 10min，13 000rpm 离心 3min， 上清即为模板。 6 HBV cccDNA 标准品的配制 HBV-c 阳性定量标准品用阴性质控品梯度稀释 10 倍、 100 倍、1 000 倍，记为 1106 Copies/ml，1105 Copies/ml，1104 Copies/ml 的标准品。 7 标本加样 HBV cccDNA 和 HBV DNA 各自的模板、阴性对照、阳性对照、标准品各 4l 加入反应管中，置全自动定量 PCR 仪上进行反应。 8 PCR 扩增 1) HBV cccDNA PCR 扩增：取 PCR 反应管按顺序放入 PCR 扩增仪中，按 下面的程序设定反应条件：93 2min，然后 94 5s 55 45s，共 40 个循环。2) HBV DNA PCR 扩增：取 PCR 反应 管按顺序放入 PCR 扩增仪中，按下面的程序设定反应条件 94 5s60 40s，共 40 个循 环。3)结果分析：以高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值。4) 质量控制：试 剂质量完好并操作正确，阳性对照应检测为相应的范围，阴性对照应表现为阴性结果。5) 结果检测：采用 Mastercycler ep realplex 专用软件分析。 9 统计学处理 采用 SPSS13.0 统计学软件进行数据处理。 HBV DNA 与 HBV cccDNA 定量值取对数变换后，符合正态分布，二者相关性采用直线相关分析；计数资料采用 2 检验，以 P0.05） 。 4 血清 HBV cccDNA 与肝组织炎症程度 23 例轻度炎症患者中有 13 例 HBV cccDNA 阳 性，阳性比例为 56.5%；35 例中至重度炎症患者中有 29 例 HBV cccDNA 阳性，阳性比例 达 82.9%，高于轻度炎症组（ 2=4.819 ，P=0.028 ） 。 讨 论 HBV cccDNA 是乙肝病毒前基因组 RNA 复制的原始合成模板，对于乙肝病毒复制以 及感染状态的建立具有十分重要的意义。HBV cccDNA 主要存在于宿主肝细胞核内，传统 检测方法是肝穿刺活组织检查，患者不易接受，取材困难，临床应用受到极大限制。近年 来，越来越多的研究表明乙肝患者血清中可检测到 HBV cccDNA，其大多来源于受损的肝 组织，在一定程度上可反映肝内 cccDNA 的水平3。随着 PCR 技术的逐步发展，血清 HBV cccDNA 的定量检测在临床上得到越来越广泛的应用。 本研究采用 PCR 方法结合 Taqman 荧光探针技术定量检测血清 HBV cccDNA，58 例慢 性乙肝患者血清中 32 例检出 cccDNA，其中 HBeAg 阳性组 cccDNA 阳性率达 67.6%，高 于 HBeAg 阴性组，与相关报道一致6 。直线相关分析也显示血清 cccDNA 载量与血清 HBV DNA 载量有很好的相关性，说明血清 cccDNA 是临床判断病毒复制的良好指标。此 外，同一样本中血清 HBV DNA 均高于 cccDNA，可能因为血清 HBV DNA 是总 DNA，包 括 cccDNA 和基因组 DNA， cccDNA 只是 HBV DNA 的一部分。 从理论上推测，当肝组织处于炎症活动阶段时，存在于肝细胞核内的 HBV cccDNA， 在肝细胞变性、坏死时也可以同转氨酶一样释放到血液中，而且肝细胞损伤越严重，血液 中的 HBV cccDNA 水平也应该越高7-8 。本研究发现， 82.9%的中至重度肝损伤患者血清 HBV cccDNA 呈阳性，高于轻度损伤者，说明血清 HBV cccDNA 与肝细胞损伤的严重程度 相关，与相关报道一致9-10。本研究还调查了血清 HBV cccDNA 与肝功能异常的关系， 统计学分析显示 HBV cccDNA 阳性、阴性者发生肝功能异常的比例无统计学意义，可能因 为 HBV cccDNA 升高先于 ALT，在 ALT 升高之前，HBV cccDNA 和 HBV DNA 就能够达 到检出水平7。 综上所述，血清 HBV cccDNA 定量检测是评 价 HBV 复制情况和肝细胞损伤程度的较为可靠的指标，与现有指标联用，必将在慢性乙 型肝炎的基础研究和临床诊治中发挥更大的作用。 参考文献 1 姜友珍乙型肝炎病毒 cccDNA 的研究进展J.中国自然医学杂志，2010，12（3）： 231-232 2 唐丽，陈瑞琳慢性乙型肝炎病毒感染者检测血清乙型肝炎病毒共价闭合环状 DNA 的 临床意义J.华西医学，2010，25（2）：331-332 3 覃亚勤，赵登蕴，刘彦慧，等慢性 HBV 感染患者血清 cccDNA 与 HBVDNA、HBeAg 关系研究J.中国实验诊断学，2009，13（9）：1193-1195 4 中华医学会肝病学分会与中华医学会感染病学分会慢性乙型肝炎防治指南（2010 版） J.临床肝胆病杂志， 2011， 27（S1）：1-16 5 中华医学会传染病与寄生虫病学分会， 肝病学分会. 病毒性肝炎防治方案J.中华肝 脏病杂志，2000，8（6）：324-329. 6 Wong DK， Yuen MF， Yuan H， et al. Quantitation of covalently closed circular hepatitis B virus DNA in chronic hepatitis B patientsJ. Hepatology， 2004， 40（3）： 727-737. 7 Chen Y， Sze J， He ML. HBV cccDNA in patients sera as an indicator for HBV reactivation and an early signal of liver damageJ. World J Gastroenterol